Aphidiconlin处理及细胞传代数对小型猪体细胞核移植胚胎发育的影响.pdfVIP

254 2011东莞第二届国际小型猪学术论坛暨大型实验动物生物医药研究应用研讨会 小型猪在心血管以及代谢系统等多方面都与人类相似，并且在基因组上与人类具有较高的同源性。因 此小型猪在全世界范围内已经广泛的应用到生物及医药研究中，并且制作了大量，包括心血管疾病，糖尿 病等多种疾病动物模型，同时通过研究证明小型猪是优于其他动物作为人类器官供体的最佳选择【l吲。自 英国罗斯林研究所将乳腺细胞核为供体注入去核绵羊卵母细胞，并成功获得克隆羊“多莉”以来【4】，体细胞 cellnuclear 核移植(somatic 实验室)成功获得克隆猪的报道【3’12~M】。为实现生产医疗型转基因小型猪，异种器官移植和家猪遗传性状 集中改良，以及分析人类基因功效，提高小型猪SCNT效率意义重大。 影响SCNT效率的因素很多，包括体细胞供体动物的年龄、组织来源、传代数、同期化处理以及供体 卵母细胞中，在减数分裂激酶的作用下最终实现供受体周期同步。未激活的MII期卵母细胞因其高活性的 成熟促进因子(maturation．promoting 因此，供体细胞的同期化处理便成为SCNT效率的关键因素之__[7,10,11,19】。 核移植时，通常使用停滞于G0／G1或pre．S期的细胞作为供体，这可以避免染色体损伤和倍型异常 然而通过研究表明血清饥饿超过2 低细胞存活率[20，211，致使胎儿流产【22】。因此，需要找到更有效同期化方法，最大程度减小供体细胞DNA 在血清饥饿后使用，能大幅度降低猪胎儿成纤维细胞血清饥饿导致的DNA损伤[2们。利用这种方法，Shi 等【l0J首次成功克隆水牛(供体细胞血清饥饿2 d)。 d后再使用O．1肛咖l的APC处理1 目前，已使用多种体细胞成功获得克隆后代【17】，但仍没有哪类体细胞可以定义为最佳的核供体细胞【25】。 胎儿成纤维细胞分化程度相对低于成体体细胞，且增殖迅速，在体外培养可在较长时间内保持正常的染色 体倍性而不发生转化，细胞老化前仍具有较强的分裂能力，留给人们较多的时间进行转基因操作和后继的 阳性细胞筛选。因此，被认为更容易在核移植后进行重编程，而广泛地用作供体细胞，特别在进行生产转 基因、基因敲出等基因修饰的大动物克隆实验中[25’261。但是，由于胎儿获得成本较高，因此胎儿成纤维细 胞作为供体细胞缺乏经济性【5】。相比而言，成体体细胞不但也能成功克隆大型哺乳动物，并且遗传背景和 饲喂状况清晰，符合医学研究和育种生产的实际要求[51。皮肤成纤维细胞取材方便，容易接种和培养，已 脏、睾丸、皮肤、卵丘和输卵管上皮细胞作为供体细胞效果，发现CC和OEC更适合用于SCNT。 虽然，APC已应用于猪胎儿成纤维细胞同期化处理，但还未见其处理猪其他类型供体细胞的报道。本 在提高小型猪SCNT的效率。 1材料与方法 1．1试剂 所用试剂如未特别注明，均购自Sigma公司。 1．2猪卵巢卵母细胞的体外成熟 卵巢采集于上海市长宁区复兴屠宰场。卵母细胞的采集和体外成熟培养参考上海市农业遗传育种重点 实验室方法进行操作【29】。 1．3供体细胞的准备 所有供体细胞取自我国巴马小型猪。EFC：成年小型猪耳部边缘洗净消毒后，剪取0．5emx0．5cmxltill 二、大型实验动物在生物医药研究中的应用 255 的组织块，剪净毛发并用含双抗的TL-HEPES·PVA(含l Tyrode’s g／Lpolyvinyl 缓冲液)冲洗干净。将组织块移到青霉素小瓶中，灭菌剪刀剪至糊状，37℃下，在含有O．5 g／L胰酶和0．5 mmol／L EDTA的高糖DMEM(DMEM；Gibco，Invitrogen min。悬浮液离心洗涤(500min)2次；以105cells／ml接种于33 g，5 mm培养皿中(ComingIncorporated， NY，USA)，含0．066