版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立.pdfVIP

46 201 1东莞第二届国际小型猪学术论坛暨大型实验动物生物医药研究应用研讨会 andthestandardcllrveswere establishedandrectified theGAPDHinternalcontrol methodCan successfully byusing gene．This serve嬲amolecularfoundationforthe oftheTNF-aanditsrolein clinicaldiseases． study many fluorescence words]Banna line；Real．time detection，TNF-a；GAPDH；Geneexpression [Key mini—pig，inbred quantitative 实验动物的选择一直是临床医学进行实验研究高度关注的问题，通过选用与人体结构、功能、代谢及 疾病特征相似的动物构建实验动物模型是保证实验成功的关键。因小型猪在心血管系统、消化系统、骨骼 发育、矿物质代谢、皮肤等方面与人极其相似，生物医学实验中常使用4“月龄，体重约10～20 kg的微型猪 进行实验【l】。版纳微型猪近交系是云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室曾养志教授带领课题 组利用全同胞和亲子交的高度近交方式加严格选择培育成功的大型哺乳动物近交系，具有遗传背景清楚、 基因纯合度和一致性高等优点，它将为生物医学实验、转基因动物研究、异种器官移植及动物模型的建立 等方面提供纯系实验动物[2-5】。 肿瘤坏死因子a(tumornecrosis 虫感染、病毒的复制、细胞生长调控及免疫调节作用，是迄今发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，它具有 直接细胞毒或抑制肿瘤细胞的作用，对肿瘤的免疫治疗具有一定的疗效【乒91。TNF-a是与临床多种疾病密切 相关的细胞因子，也是与病理性瘢痕形成密切相关的细胞因子，有人证实增生性瘢痕的形成可能与组织中 粒标准品对实验数据进行校正，从而为快速、灵敏、可靠的检测TNF-a基因的表达情况，探讨其在各种疾 病中的发生机制奠定基础。 l材料与方法 1．1实验材料 1．1．1 组织样品：选取健康状况良好的版纳微型猪近交系锱月龄猪5头，麻醉后，刮去背部猪毛， 用取皮刀去掉表皮至中厚皮，建立皮肤创面模型。然后再在取皮区的创面切取1．O-d。5toni厚、lcmx4cm 面积的创面皮肤组织，液氮速冻，．80。C长期保存。 1．1．2主要试剂及仪器：RNAiso GelDNA kit、MiniBEST Plus、Agarosepurification plasmidpurification Vector、E．coli cells mixture、 kit等试剂盒以及pMDl8．T competent DL2000DNA IIIfirst-strand for PCRMaster SuperScriptTM synthesissystemRT·PCR(Invitrogen)；SYBRgreen Mix试剂盒(北 7500。 京百泰克生物技术有限公司)；荧光定量PCR仪为ABI 1．2方法 1．2．1 RNA提取：利用RNAiso 压蒸汽灭菌30min。称取皮肤组织100 mg，将其用眼科剪刀剪碎，在研钵中用液氮反复速冻研磨至粉末状， mL 加入l RNAiso 的完整性；同时利用分光光度计检测RNA的浓度及纯度。．800C保存备用。 1．2．2 StrandeDNA eDNA合成：用Firs