康泰复方对D-IBS大鼠结肠黏膜CRH及CRH-R1mRNA表达的影响.pdfVIP

便性状异常(稀便、粘液便／便秘)等临床表现的症候群，持续存在或间歇发作，但无器质性疾病 (形态学、细菌学及生化代谢指标等异常)的证据；由于病因及其发病机制尚不十分明了，因此目 前临床尚缺乏单一、安全、完全有效的治疗IBS的药物。康泰复方是周福生教授总结多年临床经验 用来治疗D-IBS的经验方。本实验采用内脏高敏感性大鼠模型，观察康泰复方对模型大鼠直肠扩张 心胃相关理论，采用疏肝健脾、和胃安神法治疗IBS的可能机制。 l材料 1．1实验动物新生育龄7天SD大鼠，SPF级，购自广州中医药大学大学城实验中心，合格 证：0073684。 1．2实验材料和药品马来酸曲美布汀片(舒丽启能)(天津田边制药有限公司生产，生产批 公司)，Trizol 物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。 BC数控电泳仪(上海申能博彩生物科技有限公司)，UltraPI鹏UF纯水系统(上海和泰仪器有限公 II型立式压力蒸汽灭菌器(海博迅实业有限公司医疗设备厂)．GL．3250A磁力 司)，YXQ．LS．30S 搅拌器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)，SKG．01电热恒温干燥箱(湖北省黄石市医疗器械 团有限公司)．TGL．16G-A冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，HARRISELT-13v-95v34 AshevilleNc 005L-515999．OL超低温冰箱(Revco USA)，85-2c磁力搅拌器(巩义市 Technologlies Water 予华仪器有限责任公司)，UltrapureSystemwhirlpool(北京历元电子仪器公司)。 1．4中药制备康泰胶囊由南方医科大学珠江医院制，生产批号Ig药粉相当与 生药量4．19。 2方法 2．1 内脏高敏感性大鼠模型的复制和评价 2．1．1 肠道刺激新生育龄7天SD大鼠每lO只与其母鼠共同饲养在同一笼内，模型组自第l 天开始，每天给予直肠内醋酸刺激：将人体润滑剂润滑后的输液导管导管(直径Imm)经肛门插 入2cm。注入0．5％的醋酸0．5ml，连续刺激14天。从第14天后的2周内，不进行任何实验操作。 发育至大鼠25d育龄后，将母鼠与幼鼠分离。分离后的大鼠每5只一笼，给予足够的食物、水分。 2．1．2内脏高敏感性评价上述大鼠在直肠刺激停止两周后(第5周)，评价大鼠的腹部回缩 反射(A胍)。将血压计、针管与自制指套气囊用三通管连接，用针管向气囊内打气时可以在血压 计上读出气囊内压力。大鼠在清醒状态下，将人体润滑剂润滑后的气囊经肛门插入约5cm，用胶布 把导管和大鼠尾巴根部缠在一起，固定气囊。将其放在特制的透明塑料笼内，大鼠在此笼内不能转 身．15min后待大鼠适应环境，逐渐打气扩张肠道，评价其腹部回缩反射(AWR)；观察引起大鼠 腹部抬起以及背部拱起的压力阈值，比较正常组与模型组压力阈值的统计学差异。 2．2康泰胶囊对内脏高敏感性大鼠肠道敏感性的影响 上述模型组动物在模型复制成功后，在大鼠7周龄时，分别给予生理盐水、康泰胶囊1．52、3．04、 6．08 g／kg(分别相当于成人用量的5、lO、20倍)及马来酸曲美布汀片(天津田边制药有限公司生 ·378· 规饲料喂养、给水。治疗后再次进行内脏高敏感性评估，比较用药组与模型组间的统计学差异。 2．3康泰胶囊对内脏高敏感型大鼠结肠粘膜CRH及CRH．R1mRNA表达的影响 大鼠麻醉后立即开腹取远端结肠组织2块放入液氮速冻后转至．舳℃低温冰箱储存备用，用于 RT-PCR检测使用。具体方法如下：(1)按试剂盒步骤提取标本中的mRNA，在紫外同’见光分光光 出5g总RNA所需用量。(2)确定CRH 5’CTC几隗CACTGTGTCTCCAA3’。CRH．Rl 3’： Sense：5’CCAITGAACACGGCA邝G3’：Anti-serlsft CRH-RI争actirI 234 M．MuLV反转录酶，42℃水浴60分钟进行 冰上冷冻．离心片刻，加入lttL(200U／ttL)ReverAid 泳条带的光密度积分值，以样品与内参光密度积分值的比值反映各基因的表达强弱，从而对 R