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20101201，以上药物均在南京市药品检验所进行质量检验，鉴定为合格中药饮片。柳氮磺胺吡啶片
1．1．3实验试剂
hTNF吨(Pepm
克隆抗体(Cell
SignalingTechnology公司)；兔抗TLR4多克隆抗体(Santacruz公司)：鼠抗p．acfin
抗体(北京四正柏公司)；Rhodamine(TRITC)标记的二抗(Proteintech公司)；辣根过氧化物酶
life
公司)：预先染色的蛋白分子量标准品(Marker，FermentasSciece公司)；化学发光法显色试剂
(ThermO公司)；Transwelld、室(Coming公司)
1．1．4主要仪器
Maxl90
酶标仪(美国Molecular
(巩义市予华仪器有限公司)；DZF．6210真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；倒置显微
镜、荧光显微镜(Olympus)：电热恒温鼓风干燥箱(上海博泰实验仪器有限公司)；垂直电泳仪、
转膜仪(Bio-Rad公司)．
1．2方法
1．2．1体外实验
1．2．1．1中药清膏制备
按成人用量，称取上述清肠化湿方l付，共879，单味药物地榆459，分别投入提取罐中，浸泡，
煎煮2次，合并药液，予旋转蒸发仪中蒸发，减压浓缩，真空干燥箱中干燥成药物细粉。称取清肠
化湿方清膏26．439，即浸青量30．4％．地榆清青139，即浸青量28．9％．
1．2．1．2实验分组
5a培养基孵育24d,时：模型对照组：予
实验分为7组：空白对照组：加入含2％FBS的McCoy’S
清肠化湿方高剂量(1099／m1)、地榆(100pg／m1)孵育24d,时。
1．2．1．3MTT法检测不同浓度药物对HT-29细胞生长的影响
生长至80％融合时，更换为分别含有上述浓度药物的培养基继续培养，培养结束前4h，加入浓度为
组和I％DMSO阳性对照组，各组均设3个复孔。
1．2．1．4巨噬细胞趋化实验
取健康成年小鼠，腹腔注射lOml预冷无菌PBS，脱颈椎处死，沿腹中线剪开，滴管吸取注入的
5a+10％FBS培养基将分离提取的小鼠腹腔巨
PBS，NH4CI祛除红细胞，2000rpm，离心。McCoy’s
HT-29细胞，置入培养箱中，共培养15h。
细胞OD为参照，分别按公式计算各组细胞趋化指数。趋化指数=(实验组细胞OD值，对照组细胞OD
值)×100％．
1．2．1．5免疫细胞荧光检测HT-29细胞卜Bv,B、TLR4蛋白
LPS继续诱导15min，TLR4
融合至70％-80％，加／入,20ng／mlTNF．a孵育12h，NF．v,B组细胞加入Ittg／ml
LPS诱导15h，实验组同时进行药物干预。
组细胞加入lttg／ml
min，PBS洗涤3次×5min，
实验结束后，弃上清培养基，预冷的PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30
min，5％BSA封闭lh，加入按l：50稀释的一抗37C湿
0．2％TritonX-100破膜15min，PBS洗涤3次x5
盒内孵育2h，PBS洗涤3次x5
涤3次x10rain，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜观察并拍照。红色荧光为阳性染色，用lmagePro
Plus软件进行图像分析。计数入核细胞数目，观察m媚活化情况，计算阳性细胞百分率。用平均
荧光强度统计TLR4蛋白表达情况。
1．2．2体内实验
1．2．2．1动物造模及分组
采用TNBS灌肠法制作UC大鼠模型。造模型前禁食24h，随机留取lO只动物作为空白对照组，
分为清肠化湿方组、SASP组、模型组，常规饲养。
1．2．2．2药物制备及干预
大鼠按10倍成人用量给药，即清肠化湿方按139／kg用蒸馏水配成质量浓度为1．
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