三聚氰胺致NRK-52e细胞氧化应激与p38MAPK通路介导细胞凋亡的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 三聚氰胺引起的宠物中毒以及毒奶粉事件受到了全世界各国的广泛关注。三聚氰胺和三 聚氰酸本身是重要的有机化工中间产品。三聚氰胺对大鼠的慢性研究表明能引起输尿管和膀 胱结石的形成，并且雄性大鼠显著高于雌性大鼠【卜31。三聚氰酸钠对雄性大鼠和小鼠亚急性 研究发现主要是导致膀胱结石和膀胱上皮增生，对狗的慢性研究发现能导致肾纤维化，远曲 小管和集合管上皮增生、扩张，同时还发现甲状腺萎缩，淋巴细胞浸润【4】。三聚氰酸钠对孕 兔能造成体重减轻甚至死亡【51。对猫的亚慢性毒性试验提示实验动物存在肾衰竭的可能【6】o 三聚氰胺或三聚氰酸对猫、SD大鼠、小鼠和猪的急性毒性作用很低，相对于啮齿类动 物，花鲈对三聚氰胺毒性反应更为敏感。但三聚氰胺和三聚氰酸两者混合后在48h内造成急 性肾衰(猫和SD大鼠)【6一“8】。 为进一步研究三聚氰胺对机体的危害，本文研究了三聚氰胺导致大鼠肾小管上皮细胞 (NRK．52e)氧化损伤的程度和细胞凋亡情况以及Trolox对NRK．52e细胞的保护作用和 p38MAPK通路在三聚氰胺致NRK-52e细胞凋亡过程中的作用。 l材料与方法 1．1材料 DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均购于GIBCO，三聚氰胺、青霉素、链霉 素、谷氨酞胺购于Sigma。 1．2方法 1．2．1NRK．52e细胞的培养 时，用0．25％胰蛋白酶消化细胞2-5Illin，用血清终止胰酶反应。用新鲜含10％血清培养基 重悬细胞，按照1：4接种至新的培养瓶中，继续培养。冻存细胞时，将细胞消化离心后，用 lh， ．20℃2h，．80℃过夜，液氮长期冻存。 1．2．2MTT法检测三聚氰胺的细胞毒性 ． 入浓度为0mM、8mM、16mM、24mM、32mM、40 mM的三聚氰胺，培养20l垢，弃掉 DMSO，摇床避光反应10-20rain，测定A570。， 养4h．8h，弃掉旧培养基，各孔加入200pl 重复3次。 1．2．3Trolox对NRK．52e细胞增殖的影响 根据三聚氰胺细胞毒性试验，分别设置0mM、8mM、16mM、24 mM四组完成后续试 验。根据试验2．2步骤，三聚氰胺毒素稀释浓度为0mM、8mM、16mM、24mM。另外， 培养箱培养24h后，弃去旧培养基，PBS清洗1-2次，加入新鲜无血清DMEM培养基200¨1／ 孔和50肛l／孔MTT。37℃培养4h．8h，弃掉旧培养基，各孔加入200¨lDMSO，摇床避光反应 10．20rain，测定A570。，重复3次。 1．2．4NRK．52e细胞氧化损伤指标检测 中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中囝·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 ①总SOD活性：将201al待测样品加入96孔板，依次加入NBT工作液18叽l和酶工作 出SOD活性。 (多GSH．P)【活性：根据操作要求，依次将谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液、待测样品、 GPx检测工作液和15raM过氧化物试剂溶液加入96孔板，混匀。25℃使用酶标仪测定 A340nm。计算得出GSH．Px活力。 ③MDA含量：在1．5ml离心管中加入o．1ml裂解液和PBS作为空白对照，加入0．1ml 不同浓度的标准品溶液，然后加入0．2mlMDA检测工作液。混匀后，100℃煮沸加热15min。 根据标准曲线计算出样品中MDA的摩尔浓度。 @LDH活性：将待检样品、2mmol／L标准液、基质缓冲液和辅酶I适量加入10ml离心 管中。混匀，37℃水浴15min。然后加入2,4．二硝基苯肼，混匀，37℃水浴15min。最后加 将细胞培养液