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中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集
促生长机理提供试验依据及丰富铜对肉鸡能量代谢影响的知识。
1材料与方法
1．1试验材料
E
Media
培养基、地塞米松、牛胰岛素、四唑盐(MTT)和贴壁因子(SITELiquid Supplemnet)、
EDTA、HEPES和戊巴比妥钠，维生素C(L．Ascorbicacid)均购自Sigma公司；IV型胶原酶
Bovme
购自Gbico公司；胎牛血清(FetalSerum,FBS)购自天津市灏洋生物制品科技有限
公司；牛血清白蛋白(组分V)(Boyle
产分析纯。
1．2肉鸡肝细胞的分离(半原位二步灌流法)
手术前鸡禁食4h，以1750U／kg翅静脉注射肝素钠，腹腔注射50mg／kg戊巴比妥钠麻醉
剂。无菌条件下打开腹腔，结扎右肝动脉，钝性分离大网膜，拉出肠管结扎胰十二指肠静脉，
再结扎下腔静脉，最后在肠系膜静脉段结扎远心端，向肝门静脉方向插入头皮针(去针头)，
结扎固定。
137mmol／L 7．5)，待肝脏胀大至
NaCI，3mmol／LKCl，3mmol／LNa2HP04，5mmol／LEDTA,pH
原来体积的两倍时，打开胸腔剪开上腔静脉，使灌流液缓缓流出，充分排出肝脏内的血液，
7．2)，持
持续灌流10min并用镊子轻压肝脏表面；接着灌流不含EDTA的37‘C灌流液II(pH
续5min。
在完成灌流Il后，完整摘除肝脏置于网筛中(下接漏斗与三角烧瓶)，在门静脉插入导
IV
管并用镊子轻轻夹住肝门静脉口以固定导管，注入灌流液III(含0．39／LCaCl2和0．059／L
型胶原酶的灌流液II)并持续4min：消化完毕后，小心摘取肝脏放入无菌平皿中，加入30ml
剔除血管、脂肪和结缔组织，用镊子小心撕开肝脏被膜，并顺势抖动以让肝细胞自由释放进
入培养基中。然后分别过200目、400目细胞筛，所得细胞悬液用基础培养基洗2次(4℃
下50×g，Imim
L-Aseorbicacid的Williams，E基础培养基)重悬、细胞计数。
BSA，lo．g／mi
1．3肉鸡原代肝细胞的培养
1．3．1原代细胞培养
子96孔细胞培养板。细胞贴壁8h后半量更换生长液(7％胎牛血清，10‘7mol／L地塞米松，
L-Ascorbicacid)继续培养，20h后全量更换培养液。
O．2％SITE，0．15％BSA，lOpg／ml
1．3．2细胞的分组与铜处理
用超纯水配置lmM
Cu2+母液(无水硫酸铜)，工作液用基础培养基稀释母液至200pM
Cu2+试验组，在原代细胞全量换液
浓度；将细胞分为正常对照组和lOpM、50pM、100“M
十目§＆§《{e女女^H≠#e 十目·自5 mt月R★}t{$日¨e《女女
24h后分别培养30mm，1h+2h，4ht24h，48h和72h。
1 4内呜原代肝细胞活性的测定
5％
用M兀诘测定细胞的活性。在96孔细胞培养板中分别加入M嘣液(29／L)20M，于37C
波长处测定吸光值，然后按照Seth等1”介绍的方法换算出铜对肝细胞的生长抑制率(R曲aln
Proportion,Pe)。数据的采集
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