一株微生物采油菌的16S+rDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记.pdfVIP

第 26卷第 4期 徐 州 工 程 学 院 学 报 (自然 科 学 版 ) 2011年 12月 Vo1．26NO．4 JournalofXuzhou InstituteofTechnology (NaturalSciencesEdition) Dec．2011 一 株微生物采油茵的 16SrDNA鉴定和绿色荧光 蛋 白分子标记 王欲晓 ，庄文 昌 ，王 靖 (1．徐 州工程 学院 ，江 苏徐 州 221008；2．中国石油大学 化工 学院 ，北京 102249) 摘要 ：筛选到一株高效生产多糖的YX菌 ，油田先导试验证明该菌可 以用于微生物调剖提高原 油采收率(MicrobialEnhancedOilRecovery，MEOR)．经 16SrDNA 分析鉴定，YX菌属于肠 内杆 菌属 (Enterobacter．)，为跟踪监测其动态信息，构建表达绿色荧光蛋 白(greenfluorescentprotein， GFP)的重组质粒 pET一30a(+)一EGFP，利用 CaC1。法将其转化至 Yx菌 ，利用荧光显微镜可 以观 察到重组 Yx(GFP)工程菌的绿色荧光．结果表 明YX菌可 以被绿色荧光蛋 白基 因标记 ，用于微生 物采油研究． 关键词 ：微生物采油菌；16SrDNA鉴定；绿色荧光蛋 白；重组质粒 中图分类号 ：Q789 文献标志码 ：A 文章编号 ：1674—358X(2011)04—0056—05 微生物提高原油采收率 (microbialenhancedoilrecovery，简称 MEOR)是一种新型提高原油采收率的 方法．它适用范 围广、工艺简单、投资少 、见效快 、功能多、无污染、注入的微生物和营养物既便宜又容易获 得 ]，在矿场条件下易于监测 ，是 目前具有发展前景的一项采油技术．从 20世纪 50年代起，前苏联和东欧一 些 国家进行 了多次微生物采油现场试验 ，普遍取得成功 ，结果表明细菌采油对低产井效果较好 ． 筛选优秀菌种是 MEOR技术的关键所在 ，16SrDNA 的快速分析鉴定可以了解菌种的种属关系_3]，而 荧光标记可以快速跟踪和研究优势菌 的动态信息，更好 的为 MEOR技术服务．1992年 Prasher等 克隆了 GFP基因的cDNA，并分析 了GFP的一级结构 ；1994年 Youvan等 首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达 了 GFP．目前研究 表明，绿色荧光蛋 白GFP可 以作为分子标记物，通过基 因工程手段 ，在不影响微生物 自身 性状的前提下，导人生物体 ，使得新构建的生物产生易于观察的现象． 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 菌种和质粒 YX菌 ，本实验室筛选 ，可以高效生产多糖，用于微生物采油．E．coliBL21，购 自Novagen公司，用于高 效转化外源基因的菌株．质粒 pGM—Teasy，购 自华美生物技术公司，克隆载体 ，用于高效率连接 PCR产物． 包含 GFP基因的重组质粒 pET一30a(+)-EGFP，Km ，本实验室构建． 1．1．2 培养基和主要试剂 完全培养基 (g／L)：蛋 白胨 10g，葡萄糖 10g，酵母粉 5g，牛肉膏 5g，NaC15g，pH值 7．2；LB培养基 (g／L)：胰蛋 白胨 10g，酵母粉 5g，氯化钠 10g，pH7．0～7．2；LB加葡萄糖液体培养基 ：LB培养基加葡萄 糖 20g． 限制性 内切酶NcoI、SalI、EcoR工TaKaRaExTaqPremix、PCRfragmentrecoverykit、DNAMark— erDL15000购 自大连 TaKaRa；SDS、Ampicillin(sodium salt)、溶菌酶、RNaseA(Bovinepancreas)购 自上 收稿 日期 ：2011-0908 基金项 目：国家高科技 研究发展计划 (863计划)项 目(2009AA063504) 作者简介 ：王欲晓(1973 )，男，江苏徐州人，硕士，讲师，主要从事微生物采油研究． 通讯作者：王 靖 (1954一)，-k,，北京人，博士，教授，主要从事生物化学和微生物研究(swhgwj898@ cup．edu