二肽基肽酶IV抑制剂体外筛选模型的建立及应用.pdfVIP

二肽基肽酶IV 抑制剂体外筛选模型的建立及应用1 1 1 1,2* 苗雷 ，许泓瑜 ，许正宏 1 江南大学医药学院制药工程实验室，江苏无锡（214122 ） 2 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡（214122 ） E-mail:smartml@163.com 摘 要: 目的建立二肽基肽酶 IV 抑制剂的筛选模型。方法 采用 DPPIV 活性测定方法,以 Gly-Pro-PNA 为反应底物，通过测得产物PNA 量来检测DPPIV 的活性，对酶量、底物浓度、 最佳温度、pH 及反应时间进行了优化。结果 当酶量为0.5 U·L-1 、底物浓度为0.262 µmol·L-1 、 温度37℃、pH 8.2 时可获最大酶活性，并进一步对323 种中药进行了筛选，水蛭、茯神、 密蒙花等中药提取物具有DPPIV 抑制作用。 结论 此方法有效、可行，可作为DPPIV 抑制 剂的筛选模型，用来筛选以DPPIV 为靶点的降糖药物。 关键词: 二肽基肽酶IV ，抑制剂，比色法 1 引言 二肽基肽酶IV (dipeptidyl peptidaseIV, DPPIV;EC/CD26) 是位于细胞表面的一种 丝氨酸肽酶(serine peptidase)，由Hopsu-Havu和Glenner在鼠肝脏组织匀浆过程中发现的,广泛 存在于肾脏、胃肠道、结缔组织、淋巴结等组织中, 其催化活性中心位于胞外分子C末端区 [1] 域,凡N末端数第二位上存在脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽是该酶发挥活性的主要底物 。 胰高血糖素样肽- 1 ( glucagon- like peptide- 1,GLP- 1) 是由肠道内分泌细胞——L 细胞分泌 的葡萄糖依赖性肠降血糖素,在体内具有抑制血糖升高作用 [2],但因为GLP-1 的N末端两个氨 基酸为His-Ala,易被DPP Ⅳ降解而失去活性,所以体内极短的半衰期限制了其临床上的直接 应用[3] 。DPPIV抑制剂能有效延长GLP-1半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，调节血糖 浓度，国外已有此类化学合成药物上市，如默克公司的西他列汀和诺华公司的维格列汀，还 有许多已进入三期四期临床阶段，相比以上合成药物从天然药物中筛选DPPIV抑制剂有许多 优点，除了毒性低，生理条件下更为稳定外，还有望为合成新药提供更多的化学结构，因此 建立一种可对天然药物进行DPPIV抑制剂筛选的模型具有理论和实际意义。 发现高效、特异性好、以 DPPIV 为靶点的降糖药物，首先需要建立快速、灵敏、可 靠、方便的药物筛选模型。目前国际上筛选 DPPIV 抑制剂的方法主要有以带荧光基团 （AMC/AFC ）的 Gly-Pro-AMC/AFC 为底物的荧光底物法和以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺 （Gly-Pro-PNA ）为底物的发色底物法。前者通过荧光分光光度计测定荧光值高低来确定酶 活。这一方法相对可靠，快速，灵敏度高，但成本、技术和仪器要求均比较高，不适合国内 普通实验室开展大规模药物筛选，而后者源于 Nagatsu T, Hino M, Fuyamada H 等人在 1976 年建立了一种以 Gly-Pro-PNA 作为底物检测体内 X-prolyl dipeptidy-aminopeptidase 活性的方 -1 -1 法，该方法建立的反应体系为 75 µmol·L glycyne-NaOH 缓冲液、1.5 µmol·L [4] 。之后以 Gly-Pro-PNA 作为底物检测 DPPIV X-Y-p-nitroanilide 、酶、纯水，总体积为