荧光原位杂交(FISH)产品质量标准及检验技术平台的建立和应用.pdfVIP

引物法、末端标记法、PCR标记法，其中缺口平移法 交无信号或信号微弱的可能因素有标本变性不充 使用较为广泛，标记后探针片断的大小分布范围在 分、标本未制备好、探针与杂交液未充分混匀、变性 不充分、杂交湿度不够、杂交时盖玻片下有气泡等； 100～750bp较适宜。为了降低FISH杂交背景，需 要对探针进行纯化，以去除标记体系中的各类酶、d 造成杂交信号特异性低的可能因素有探针与杂交液 NTP等，纯化过程可采用市售的各种PCR产物纯 配制不当、杂交条件不当、洗涤温度过低、洗液洗涤 化试剂盒进行，纯化后的探针在FISH杂交时信号强度过低等；造成复染过强或过弱的可能因素有复 强度应明确，背景低，无明显的交叉杂交现象。 染剂浓度错误、复染剂陈旧或过度光照等。 1．2．2探针与待检材料的杂交 2．FISH产品质量标准建立 杂交流程主要包括样本玻片的变性、探针的变 2．1FISH产品质量控制关键点 性、探针与样本的杂交、洗涤等步骤。其中变性的温 FISH检测产品通常由荧光标记探针、杂交缓 度和时间非常重要，变性温度通常为73℃土1℃，变 冲液、洗液、复染剂等组成。荧光标记探针是其主要 性时间为5分钟。将变性后的探针滴于玻片杂交区 成份，荧光标记探针能否有效地与待检材料中目标 域，在温度为37～42℃下过夜进行杂交，整个杂交DNA有效结合并被及时检测到，是该类产品关键技 过程要保证一定的湿度，以保证杂交的充分进行。 术点，因而也是其质量控制关键点。制定FISH产 杂交后将样本玻片依次置于50％甲酰胺／2×SSC品质量标准应围绕这一关键点进行。 溶液、2×SSC溶液、2×SSC／0．1％NP一40溶液中洗2．2质量标准建立 涤一定时间，以去除杂交背景。 2．2．1外观和物理性状 1．2．3荧光信号检测 探针溶液应为澄清、透明的浅粉色液体，杂交缓 用于探针标记的常见荧光素有Rhodamine、冲液应为澄清、透明的粘稠状液体。 通过肉眼观察产品外观和物理性状可以初步判 FITC、SpeetrumOrange、SpeetrumGreen、DEAC、 Aqua等。每种荧光素都具有其特征性的激发波长断产品性质，是产品质量控制最基本的，也是重要环 和发射波长，根据这些波长信息配置荧光显微镜的 节之一。 相应滤光片组，用来检测对应的荧光信号。高分辨 2．2．2荧光原位杂交探针信号强度 率的荧光冠微镜和专业化的图像分析系统对FISH 探针在与待测样本有效杂交后，经洗涤、复染等 检测至关重要，在用荧光显微镜观察FISH信号时，必要操作程序，在指定的荧光显微镜，一定的放大倍 可先在10倍镜下寻找到合适的区域，再转至100倍数下，应能发出可被肉眼观察到的荧光信号。 油镜下通过滤光通道的切换观察信号情况。 2．2．3荧光原位杂交探针质量检验 1．2．4样本制备 荧光原位杂交探针应能杂交到目标染色体的特 根据诊断的需要选取特定的样本用来进行 定位点。建议此实验在外周血淋巴细胞中期分裂相 FISH，FISH使用的样本类型较为广泛．常见的有上迸行。 组织切片、羊水、尿液、骨髓等。在石蜡组织切片的 2．2．3．1杂交灵敏性 制作中，新鲜组织取下后应在1个小时内放入10％ 杂交实验完成后，能在中期细胞目标染色体观 中性福尔马林溶液中固定，同定时间应在6～48小 察到的杂交信号的百分率。 时之间，制作的石蜡切片厚度不宜超过5tam。羊水 以北京金菩嘉医疗科技有限公司HER一2基因 样本的制备程序通常包括收集细胞、胶原酶消化、低 检测试剂为例说明：HER一2基因位于人类17号染 渗、预固定、固定、细胞悬液的制备与保存、制片、老 色体上。人类17号染色体是较小，亚中央着丝粒染