商陆抗病毒蛋白基因克隆、序列分析及原核中表达.pdfVIP

维普资讯 中国农业科学 2002，35(4)：390 393 商陆抗病毒蛋白基因的克隆、序列 分析及在原核中的表达 陈定虎，王锡锋，李 莉，周广和 t植物病虫害生物学国家重点实骑室．1fl围农 科学院植物保护研究所，北京 100094 摘要 ：从美洲商诗(Phsc~lazraamericana)叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了完整的总RNA，经RTFCR扩增 出缺失鬟娈型PAP基因，将谈基因与克隆载体pGEM(r)．1相连接，从SP6和 J7两端同时对其进行序 列测定，共 测得 711个碱基．与国外报道的PAP基圈序列相比较，其同源性达 99．6％。同时牛争谖基 固克隆至原桉表达载体 pET-5a上，转化大厨杆酋菌株P,L21(DE3)ply-~S，在 04reotol／IIFIG 的诱导下表述，经SD8分析表明．谖 基因在大肠杆菌中得到了特异性表达，表达蛋 白大小为26ku，与预期值相符。Westernblotfing分析发现谴表达蛋 白与法国PAP抗血清有特异反应 琼脂最扩散免疫沉淀浩鉴定发现表达蛋白与其 自己的抗血靖及法国的PAP抗 血清均能形成免疫沉淀线，里这两条沉淀线在相亮处呈融合状态，说明原梭表述的该蛋 白与法国从商陆叶片中提 取出的PAP具毒高度的同薄性．也说明本试验准确克隆到了PAP基固且在大肠杆菌中{旱到了表达。 关键词：美洲商陆；PAP基因；序列分析；厚枝表达 TheCloning，Sequencing ofPokeweedAntiviralProtein Geneand ItsExpressioninE．coli CHEN 1)inghu，WANG Xifeng，LILi．ZHOU Guang—he trh StateKeyLuboratorw。ftheBioloKvofPlant s andPest fr~tituteofPalntProtection，CAAS，B~fing100094) Abstract：ThetotalRNAt~asimlatedfrompokeweed(Phytolaccaamericana)leavesusingthemethod of guanidinei~)thiocyanteandusedastemplatetoamp[ifythedeletedmutantpokeweedantiviralprotein(PAP) genebyRTPCRandthenthegenewasclonedintopGEM(r)一T vector．Thesequencingresu[tsshowedthat PAPgenehad71lntwhichhas99．6％ identitycompanngwiththePAP genenucleotideesquencereportedby Linetal(1991) IheIPTG inducibleexpressionvectorcontainingthePAPgeneWas constructde andtrans— ferredintoE coliBL2I(DE3)一plyaS IhespecificproteinWasproducedafterinducingwith0．4mmol／LIPTG anditsmolecularweightwas26ku．Thoroughtestingbyusingdouble—diffusiononagarplateandWesternblot tingtheresaltsshowde thatexpressionproductinE．coliishighidentitywithPAP extractedbyaFrenctmaen from Frenchpokeweedlaeves．Thees revealedthatPAPgenehadbeenactuallyachievde andexactlyexpressde in E coli Keywords：Ph3Colaccaamericana：PAPgene；Sequenceanalysis；Prokaryoticexpression 用生物技术方法