钙离子及山梨醇对猪卵母细胞孤雌激活的影响.pdfVIP

上海市畜牧兽医学会2011 年学术年会论文集  及山梨醇电激液对猪孤雌激活的影响，旨在分析包括交流电及混合电激液等诸多种因素对卵 母细胞激活效果的影响。 1 材料和方法 1.1 化学试剂 本研究用于卵母细胞体外成熟，激活以及孤雌发育所涉及的生化试剂除标注 以外，均购自Sigma公司。 1.2 卵母细胞的采集和体外成熟 卵巢采集于上海市长宁区复兴屠宰场。卵母细胞的采集和 体外成熟培养按上海市农业遗传育种重点实验室方法进行[8] 。 1.3 卵母细胞的激活和胚胎培养 1.3.1 成熟卵母细胞挑选和激活 COCs 培养44 h ，移入含0.1%透明质酸酶的 PVA-TL-HEPES （含0.1pyruvate polyvinyl alcohol(PVA)的TL-HEPES ）液中，反复吹打除去 颗粒细胞。选取胞质均匀形态正常且排出第一极体的卵母细胞，在相应电激活液中洗涤平衡 1~3min 后，于电极间距为0.5 mm 的电融合槽中，以Electro Cell Manipulator 2001 （BTX ， San Diego，CA ）进行电脉冲。 1.3.2 电激活液Ca2+浓度与脉冲强度对孤雌激活的影响 成熟卵母细胞随机分为12 组 （4×3 ），分别在含钙0.01、0.05、0.1、0.5mmol/L 的电激液中（激活液其他成分为0.3mol/L 甘露醇，0.1 mmol/L MgCl2 ，0.01% （w/v ）PVA ，0.5 mmol/L HEPES，pH7.2 ），对应分别施 以单次0.8、1.2、1.6kV/cm，持续30 μs 的直流脉冲，然后转入胚胎培养液培养，2 d 后检查 卵裂率和退化率，7 d 后检查囊胚率。 1.3.3 脉冲强度对山梨醇电激活液激活效果的影响 成熟卵母细胞随机分为6 组，一组使用 含0.3mol/L 甘露醇，0.1 mmol/L CaCl ，0.1mmol/L MgCl ，0.01%PVA，0.5mmol/L HEPES 2 2 的电激液（pH7.2 ），以单次30 μs，1.2kV/cm 的直流脉冲激活；其余5 组使用含0.3 mol/L 山梨醇，0.1 mmol/L CaCl ，0.1 mmol/L MgCl ，0.01%PVA，0.5 mmol/L HEPES 的电激液， 2 2 分别以单次0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 kV/cm，30μs 直流脉冲激活。然后转入胚胎培养液培养， 2 d 后检查卵裂率，7d 后检查囊胚率及囊胚细胞数。 1.3.4 交流电对孤雌激活的影响 成熟卵母细胞随机分为4 组（2×2 ），两组使用甘露醇电激 液、两组使用山梨醇电激液（成分均同试验2 ），以单次30μs，1.2 或1.6kV/cm 的直流脉冲 电激活。每种电激液各有一组在直流脉冲前，先施加10s，0.05kV/cm 的交流脉冲。电激后， 转入胚胎培养液培养，2d 后检查卵裂率和退化率，7d 后检查囊胚率。 1.3.5 交流电作用下混合电激液对孤雌激活的影响 成熟卵母细胞随机分为4 组，直流脉冲 前均施加交流脉冲（参数同实验3 ）。两组使用混合电激液（山梨醇和甘露醇电激液等体积 混合液）激活，分别施加单次30 μs，1.2 或1.6k V/cm 直流脉冲；另两组分别以甘露醇电激 液（单次30 μs， 1.2 kV/cm 直流脉冲），山梨醇电激液（单次30 μs，1.6 kV/cm 直流电）电 激活。电激后转入胚胎培养液培养，2 d 后检查卵裂率和退化率，7 d 后检查囊胚率。 1.3.6 孤雌胚胎体外外培养 电脉冲后，卵以含7.5 μg/mL Cytochalasin B （CB ）的 NCSU-23+0.4%BSA （w/v ）培养液洗三遍后，培养4h ；再转入无CB 的NCSU-23+0.4%BSA 液滴中培养，每滴含15~20 枚卵，加盖矿物油。培养条件为温度38.5 ℃，5%CO2 ，相对湿 度100%。囊胚细胞计数采用10 μg/mL Hoechst33342 染色压片，在荧光显微镜下记录囊胚细 胞数。   2