斛芪浸膏对60Co辐照后小鼠胸腺淋巴细胞氧化损伤影响.pdfVIP

RPMll640培养液，胎牛血清(GIBCO)；小鼠淋巴细胞分离液(深圳达科为Ez—SepMouse)； 活性氧检测试剂盒 (江苏碧云天生物技术研究所S0033)；超氧化物检测试剂盒(江苏碧 云天生物技术研究所，SuperoxideAssay 标仪(BioTeck FACSCalibur)。 ELX808)；流式细胞仪器(美国BD 2．方法 2．1昆明小鼠胸腺细胞原代培养 昆明小鼠乙醚麻醉后，颈椎脱臼处死，75％乙醇溶液浸泡15分钟。在超净台上，无菌剪 开小鼠胸腔，取出胸腺，用无菌PBS漂洗干净，研碎过200目筛网。将取得的胸腺细胞悬浮 于小鼠淋巴细胞分离液中，2200转／分，离心30分钟。吸取淋巴细胞层至新离心管中，用 调成单细胞悬液。用4％台盼蓝溶液染色，以显微镜下计数活细胞率95％判为合格，将细胞 悬液置无菌培养皿中，5％C02孵箱37．OoC孵育4小时。 2．2实验分组和辐照 将胸腺细胞悬液分为5组：即对照组、辐照组、辐照加低剂量斛芪浸膏组、辐照加中剂 量斛芪浸膏组、辐照加高剂量斛芪浸膏组。对照组和辐照组加等量无血清RPMll640培养液， 膏溶液。5％C0。孵箱37．0℃孵育10小时。 电离辐射使用第二军医大学辐照中心”co放射源。辐照组和辐照加斛芪浸膏低、中、高 剂量组均一次性5Gy”Co—Y射线辐照。 2．3流式细胞仪检测小鼠胸腺淋巴细胞活性氧(ROS)含量 将各组细胞用无血清1640培养液清洗两次，调整各组细胞浓度为2×106／m1，重悬于 IJ RPMll640培养液清洗两次，每组样品留取2001。本实验为装载探针后进行”Co辐照，辐 照后30分钟内用流式细胞仪检测各组细胞内平均荧光强度，用流式细胞仪CellQuest软件 进行自动分析。各组细胞内ROS荧光强度用百分率表示，结果用流式直方图显示。 2．4酶标仪检测小鼠胸腺淋巴细胞超氧化物含量 收集各组细胞，用PBS清洗两次，调整细胞密度为1×105／个ml，将细胞重悬于超氧化 IJ1(SOD 物检测工作液，接种于96孔细胞培养板中，每组设3个复孔，每孔含细胞悬液200 组每孔加SOD溶液2ul，SOD溶液为检测试剂盒附带阳性对照试剂)。本实验为接种96孔板 后进行”Co辐照，辐照后30分钟内用酶标仪检测各组细胞吸光度值，检测波长450nm。 上述实验均独立重复三次。 2．5统计分析 采用SPSSl6．0统计软件，计量资料数据用f±S表示j组间差异采用单因素方差分析， 组问两两比较用LSD检验。取o=O．05，p0．05为差异有统计学意义。 3．结果 3．1斛芪浸膏对小鼠胸腺淋巴细胞内活性氧的影响 辐照后30分钟，与单纯辐照组比较，辐照加低、中、高剂量斛芪浸膏组均能不同程度 降低细胞内活性氧的水平，使DCF荧光光谱分布位置左移，且在一定范围内呈现剂量依赖性。 (表1，图1) 3．2斛芪浸膏对小鼠胸腺淋巴细胞内超氧化物含量的影响 辐照后30分钟，与单纯辐照组比较，辐照加中、高剂量斛芪浸膏组均能抑制细胞内超 显示出了比斛芪浸膏各浓度组更强的抑制超氧化物的作用，差异有统计学意义(PO．05) (表2) 199 4．讨论 电离辐射对生物体的损伤在近期主表现为免疫力下降、骨髓抑制、感染、出血等，远 期则可能会出现畸形、癌变，但其均是通过电离辐射透过生物组织时产生的直接效应和间接 ive i 效应而实现的。电离辐射使水解聚而产生活性氧(reactoxygenspeces，ROS)，进而攻 击蛋白、核酸、染色体等生物分子，这就是间接效应，绝大多数电离辐射所引起的损伤主要 是由活性氧来介导、调节的[5]，而活性氧的平衡状态则被视为抗氧化剂影响辐射问接效应 的机制之一[6]。 活性氧包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等参与多种生理病 理过程。DCFH-DA是目前十分常用和灵敏的细胞内活性氧检测探针，本身没有荧光的DCFH—DA 进入细胞内后，可转化生成DCFH，在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，