HPLC兽药等同时检测方法Ⅱ(畜水产品).pdf

HPLC 兽药等同时检测方法 Ⅱ（畜、水产品） 1．分析目标化合物 参照附表 2．仪器设备 带多波长检测器的高效液相色谱仪（HPLC-DAD）或带电化学检测器的高效液相色 谱仪（HPLC-ECD）或液相色谱—质谱仪（LC/MS）。 3．试剂 除下列试剂外，使用附录2所列试剂。 乙腈：液相色谱用； 水： 液相色谱用； 甲醇：液相色谱用； 磷酸缓冲液（pH3.0） 第1液：称取27.2g磷酸二氢钾，加水溶解，至1,000 mL。 第2液：称取2.31g磷酸，加水溶解，至100 mL。 在第1液中加入第2液，混合，调整 pH为3.0。 磷酸缓冲液（pH5.0） 第1液：称取27.2g磷酸二氢钾，加水溶解，至1,000 mL。 第2液：称取3.48g磷酸氢二钾，加水溶解，至100 mL。 在第1液中加入第2液，混合，调整 pH为5.0。 兽药等标准品：标明各兽药等的纯度。 4．试验溶液制备方法 1）提取方法 ① 肌肉、肝脏、肾脏、奶和其它可食部分 称取5.00g样品，加入30 mL 95%乙腈水溶液，搅拌均匀后，以毎分钟2,500转离 心分离5分钟，收集乙腈层。残留物中加入30 mL 95%乙腈水溶液，激烈振荡后， 按上述同样离心分离，合并所得乙腈层。 ② 脂肪 称取5.00g样品，加入30 mL 95%乙腈水溶液和30 mL正己烷，搅拌均匀后，以毎 分钟2,500转离心分离5分钟，收集乙腈层。残留物及正己烷中加入30 mL 95%乙 腈水溶液，激烈振荡后，按上述同样离心分离，合并所得乙腈层。 2）净化方法 ① 合成硅酸镁柱色谱法 在内径15 mm、长300 mm 色谱管中、装入8g悬浮在乙腈中的柱色谱用合成硅酸镁， 放出乙腈，使柱上端留有少量乙腈。柱中注入100 mL乙腈，舍弃流出液。顺次注 入1）所得溶液和30 mL乙腈，收集溶出液。加入100 mL 正己烷，用振荡器激烈 振荡3分钟后，静置，收集乙腈层，40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物中加入4mL 磷酸缓冲液（pH5.0）溶解，加入6mL水。 ②十八烷基甲硅烷基化硅胶柱色谱法 在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱(360 mg)中，顺次加入10 mL甲醇、10 mL水和2mL 磷酸缓冲液（pH5.0），舍弃流出液。柱中注入ａ所得溶液后，注入5mL磷酸缓冲 液（pH5.0），舍弃流出液。顺次注入10 mL 40%甲醇水溶液和10 mL 70%乙腈水 溶液，分别收集溶出液，40℃以下浓缩，除去溶剂。在40%甲醇水溶液得到的残 留物中加入2.0 mL5%甲醇水溶液溶解，在70%乙腈水溶液得到的残留物中加入2.0 mL 35%甲醇水溶液，分别作为试验溶液。 5．制作标准曲线 各兽药等的标准品分别配成甲醇溶液，附表C18 组分A 的兽药等用5%甲醇水 溶液稀释，附表C18 组分B 的兽药等用35%甲醇水溶液稀释，配制成数个在适当 浓度范围的制作标准曲线用的标准溶液。分别注入200μL 于 HPLC 中，用峰高 法或峰面积法制成标准曲线。 6．定量 注入 200μL 试验溶液于 HPLC 中，根据5的标准曲线，求得各兽药等的含量。 7．确证试验 用 LC/MS 或 LC/MS/MS 确证。 8．测定条件 检测器：参照附表 柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径5μm），内径4.6 mm、长250 mm 柱温：40℃ 流动相： HPLC-DAD：乙腈：水：磷酸缓冲液（pH3.0）混合溶液从（1：18：1）到（14：5： 10）的浓度梯度运行30分钟，在（14：5：1）保持10分钟。 HPLC-ECD：乙腈：0.085 mol/L 磷酸二氢钾溶液（2：3）混合溶液。 检测条件：参照附表 9．定量限 参照附表 10．注意事項 1）检测方法概述 本方法用95%乙腈水溶液从样品提取各兽药等，合成硅酸镁柱色谱法乙腈/ 正己烷分配，再用十八烷基甲硅烷基化硅胶柱色谱法后， PHLC-DAD或PHLC-FL 测 定。 2）注意点 ① 附表是将适用本方法的化合物按照五十音符的顺序表示的。规定的品种中， 如有不适用本方法的代谢物等的化合物时应注意。 ② 本试验方法不能保证能同时分析附表中所列的全部化合物。因化合物间的相 互作用而分解等和干扰测定等原因，预先将测定的化合物合并成组，并有必要验 证这些点。 ③发生空气氧化、光分解的兽药等，全部操作在避光下迅速进行。 ④标准品溶于甲醇时，以少量N,N-二甲基甲酰胺溶