天麻素钩藤碱配伍对血管内皮细胞的保护作用.pdfVIP

血管内皮细胞损伤常导致高血压及动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生发展，是“内 皮－高血压－心血管事件”链起动因子和载体，是高血压病的重要发病机制之一。同型半胱 氨酸（Hcy ）水平与高血压水平呈正相关。Hcy增高引起细胞损伤，通过降低一氧化氮合酶 eNOS 的合成与活性致NO 生成减少，从而引起内皮依赖性血管舒张功能失调导致高血压发生 [1] 。 微囊蛋白Caveolae是细胞膜上有一种特殊类型的脂伐结构，主要的生理功能是调节细胞 信号。Caveolin-1 （CAV-1 ）是其家族成员中与心血管疾病关系密切的一类亚型，在心血管 内皮组织中，CAV-1 在eNOS合成NO 以及内皮生长和重塑过程中是一个关键的调节因子。研 究表明，内皮功能受损，CAV-1 表达量增加，CAV-1 通过脚手架（CSD ）结构调节细胞信号 [2] [3] ，当eNOS结合到CSD上，eNOS失活，导致NO 的合成受到了限制 。NO作为正常生理活 动进程的中心，在开发心血管保护药物中，研究CAV-1/eNOS调节的药物十分必要。 天麻和钩藤是降压名方天麻钩藤饮的两位君药，天麻素与钩藤碱是天麻、钩藤中主要活 性成分。多数学者认为天麻素和钩藤碱对心血管系统具有一定的保护作用。本研究通过观察 天麻素钩藤碱配伍药物对 Hcy 损伤的血管内皮细胞保护作用，探讨其降压功效产生的机制。 1 材料 1.1 药物 天麻素（gastrodin，98%，成都第一制药有限公司) ；钩藤碱（自提，纯度 80%~95%） 1.2 细胞株 人脐静脉内皮细胞株（ECV-304 ）：购于武汉大学“中国典型培养物保藏中心（CCTCC ）” 1.3 仪器与试剂 CO2培养箱（美国Thermo公司）；XDS-220C型倒置显微镜（蔡康光学仪器厂）；酶标仪 （美国Bio-Rad公司）；EPS 300 垂直电泳仪（上海Tanon科技公司）；DYCZ-400 电转移装置 （北京市六一仪器厂）；TY-80B脱色摇床（南京新校园生物技术研究所）；DMEM培养基 （Gibco公司）；MTT （Sigama ）；DMSO分析纯（南京化学试剂有限公司）；同型半胱氨酸（阿 拉丁公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；胰蛋白酶（Gibco ）；NO试剂盒、 丙二醛（MDA ）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH试剂盒）（南京建成生物工程研究所）；化学发 光剂（北京碧云天）；抗体（Anbo公司） 2 实验方法 2.1 细胞培养 将冻存的ECV304 细胞复苏，用含有 10%胎牛血清的DMEM接种于细胞培养瓶。放置于 37℃，5% CO 培养箱培养 12h。待细胞长满瓶底 80%后，加入 0.25%胰蛋白酶消化传代。 2 2.2 MTT 法检测药物对细胞的毒性及量效关系 2.2.1 实验分组 （1）对照组：加入 10%DMEM培养基；（2 ）模型组：1000 μmol ·L-1 Hcy ；（3 ）实验组： 分别加入含 0.5、1、5、10、50、100、500µg•mL-1天麻素钩藤碱 1:5 配伍的 10% DMEM培 养基；（4 ）调零组：加入无细胞培养基。每组设6 个复孔。 2.2.2 细胞毒性检测 （1）收集对数期EVC-304 细胞，在 96 孔板中，接种细胞悬液 100μL 至对照组和实验组； 37℃恒温培养箱中继续培养，待细胞长满 80~90%后，实验组加入不同浓度药物溶液 100μL 。 对照组和调零组加入培养基 100μL 。每孔终体积 100μL 。 （2 ）5%CO2 ，37℃分别孵育 12、24 、36、48h ，倒置显微镜下观察。每孔加入 16μL MTT 溶液，在 37℃恒温培养箱中继续培养4h 。 （3 ）将上清吸净，加入DMSO150μL ，置摇床上低速振荡 10min，使蓝色结晶物充分溶解。 用酶标仪在 490nm 波长处测量各孔的吸光度。设对照组的细胞相对活力为 1，其他组的细胞 相对活力为实验组与对照组的比值。 2.2.3 量效曲线绘制 96 孔板中，除调零组外，接种细胞悬液 100μL 至对照组、模型组和实验组；37℃恒温 培养，模型组中加入 Hcy 溶液 100μL ，其余操作同2.2.2 。 2.3 药物对血管内皮细胞损伤 MDA 释放影响 2.3.1 实验分组 （1）对照