按摩对肥胖模型大鼠作用机制的研究.pdfVIP

1.2 主要试剂及仪器 NPY 检测试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供，电子天平(上海天平仪 器厂) ，恒温干燥箱，LEICA2135 型石蜡切片机，Olympus 倒置相差显微镜（德 国）。 1.3 方法 [3] （1）高脂饲料制作：高脂饲料参考文献中 饲料配方，组成及比例为食用猪油 20% 、白砂糖 10%、脱脂奶粉 10%、胆固醇 2% 、胆盐 0.5%、食用盐 5%，其余 53.5%为普通饲料加工而成，普通饲料为实验动物标准饲料，由贵阳医学院实验 动物中心提供。 （2 ）造模方法：适应性喂养3d 后，测量大鼠初始体重，依照文献中用高脂饲料 喂养 4 周建立肥胖大鼠模型方法对大鼠进行造模。造模期间，正常组普通饲料喂 养，造模组高脂饲料喂养，各组饲料每天一次性投放，每天对大鼠饮水量、摄食 量等一般情况进行动态监测，每 3 d 同一时间点测量大鼠体重。4 周后，大鼠禁 食 12 小时后准确称取大鼠体重、测量体长，计算 Lee’s 指数，进行模型评估。 治疗期间，正常组、模型组和治疗组均采用普通饲料喂养。实验期间各组动物自 由摄食和饮水。 （3 ）模型评价：在模型制备周期结束后，根据人类肥胖和超重标准对肥胖度大 [4] 于 20%视为肥胖并作为肥胖模型建立成功标准 。肥胖度计算公式：肥胖度(%)= （试验组实际体重-对照组平均体重）/对照组平均体重×100%。凡体重未达标准 的造模组大鼠，予以淘汰。造模组45 只大鼠中有 27 只符合肥胖标准（重超过正 常组平均值的 20% ），造模成功率为 60% 。在模型制备过程中正常组大鼠死亡 1 只，模型组和治疗组大鼠各死亡 2 只。 （4 ）治疗方法：治疗组以常规手法给予大鼠腹部按摩，持续治疗 6 周。治疗以 左手固定大鼠，右手做手法，主要手法有:①掌指顺逆时针揉腹；②掌指顺逆时 针揉两侧腹；③指顺逆时针揉腹股沟及生殖器周围脂肪组织；手法缓和，用力均 匀持久，每个部位各揉 5min，频率 120 次/min ，每次治疗 15min （如大鼠紧张不 与配合固定或按摩时，可先给大鼠在背部做抚摸放松手法，待大鼠放松后再做按 摩）。 （5 ）检测方法 735 体重、体长、lee’s 指数测量：治疗结束后，分别用皮尺，普通天平测出所有 大鼠的体长（体长测量：麻醉后测量从鼻尖到肛门长度）和体重，并根据体重和 体长计算出 Lee’s 指数。Lee’s 指数= 3 体重（g）103 / 体长（cm） 免疫组织化学法检测步骤：①取脑组织使用 10%多聚甲醛固定，制作按照 HE 染色法切片制作方法制作切片；②3%过氧化氢溶液 37℃孵育 30min，以灭活 内源性过氧化物酶，磷酸缓冲液（PBS ）冲洗 10min×3；③3%正常羊血清，37℃， 孵育 30min，封闭非特异性抗原；④吸去羊血清，加入浓度为 1:4000 的兔抗鼠 a-MSH 第一抗体（阴性对照实验用磷酸缓冲液（PBS ）替代第一抗体），4 ℃，孵 育 48 小时，磷酸缓冲液（PBS ）冲洗 10min×3；⑤加入浓度为 1:100 的生物素标 记的羊抗兔第二抗体，37℃，孵育4h ，磷酸缓冲液（PBS ）冲洗 10min×3；⑥加 入浓度为 1:100 的ABC 复合物，37℃，孵育 2h ，磷酸缓冲液（PBS ）冲洗 10min×3； ⑦ 0.1M AB 洗 3～5min，浸入 DAB 显色液中，不时地摇动，30 分钟内观察显色， 显色充分后，用 0.IM AB 终止显色；⑧裱片，室温下晾干，梯度乙醇脱水，二甲 苯透明，中性树胶封片；⑨镜下观察，照相，计数下丘脑中的 NPY 免疫阳性细 胞数。 1.4 统计学处理 实验数据均以x ±s 表示，应用 SPSS 17.0 统计软件统计处理，采用方差分析 （One Way ANOVA ）和X2 检验。 2 实验结果 2.1 造模期间大鼠体重、体长和 Lee’s 指数的变化 表 1 显示，造模前，各组大鼠平均体重无显著性差异（P ＞0.05 ），并且组间 平均体重随着造模时间的增长体重差异逐渐加大。表 2 显示，造模后, 造模后体 重和 Lee’s 指数比较，造模组较正常组差异有极显著性意义(P0