针灸对实验性肠炎模型大鼠结肠CCR7、SLC及外周血TNF-α的影响.pdfVIP

CD)。本病发病机制目前认为是遗传、免疫、感染等多因素相互作用而 致的免 疫反应异常。肠黏膜免疫功能主要通过肠淋巴细胞归巢(lymphocytehoming, LH) 实现，CCR7 的相应配体次级淋巴组织趋化因子(Secondary Lymphoid tissue Chemokine, SLC) 目前认为是第一个参与体内淋巴细胞归巢的趋化因子，SLC 于 HEV 处激活CCR7，进而活化T 细胞整合素，使其与LH 地址素特异性结合，降低 致敏淋巴细胞的滚动速度并黏 于HEV 内皮上，使淋巴细胞易被 HEV 内皮细胞 捕获。CCR7 与 SLC 特异性识别和黏 ，构成了淋巴细胞特异性归巢至肠黏膜组 织的分子基础。IBD 的发病是肠内多种不同信号途径及细胞类型交互作用的结 果，肠上皮及效应免疫细胞间的相互作用是启动炎症并使炎症持续的关键的病理 [1,2] 机制，参与IBD 的慢性炎症反应，促进及放大细胞相互作用 。临床研究表明， TNF- α在肠道炎症中有重要调节作用。细胞因子、趋化因子在炎症的级联反应 [3] 中起到关键作用，两者的协同表达可加重组织损伤，使疾病恶化 。本研究应用 DNCB 免疫加乙酸局部灌肠刺激法，制备实验性肠炎大鼠模型。因此，本课题采 用免疫组织化学及酶联免疫吸 等技术和方法，观察结肠组中CCR7、SLC 蛋白表 达及外周血TNF- α含量变化，为进一步阐明实验性肠炎的发病机制及针灸对其 的治疗作用提供理论 据。 1 材料与方法 1.1 材料 体重为150±20g 雄性清洁级Wistar 大鼠65 只 （岳阳医院动物实验中心）； DNCB(Sigma)；TNF- α检测ELISA 试剂盒(RDsystems)；CCR7 抗体(AbcamLtd)； SLC 抗体 （北京雷根生物技术有限公司）。 1.2 方法 （1）造模及分组 正常饲养一周后将65 只大鼠称重后，随机均分为5 组， 取1 组 （13 只）作为 正常组对照组，余4 组 （共52 只）分别为模型组、电针组、隔药 组、温和 组均使用DNCB 免疫加乙酸局部灌肠刺激法制备实验性肠炎大鼠模型。以2%DNCB 丙酮液0.25ml（5 滴）滴背，连续14 天致敏；第 15 天经 门处灌肠注入0.1%DNCB 乙醇液0.25ml；第 17 天同部位灌肠注入8%乙酸溶液2ml，准确计时10 秒后， 用5 ml 生理盐水冲洗，造模完成。经模型验证确认造模成功后进行治疗。正常 249 组不进行任何治疗；模型组只作与治疗组相同的固定，不治疗；其他三组均取天 枢 （双）、气海穴，定位参照人体腧穴定位及 《实验针 学》（李忠仁主编. 中国 中医药出版社，2007 年出版），温和 组采用直径5mm 小艾条点燃后在距离穴位 1-2cm 处施 ，每次每穴各 10 分钟，每日1 次，共 7 次；隔药 组将 子、 肉桂、丹参等药研末，用黄酒调制成糊，压成直径5mm 厚3mm 药饼，选用精制艾 绒约90mg 制成椎体状艾炷，每次每穴各 2 壮，每日1 次，共 7 次；电针组 选用直径0.25mm、长25mm 毫针，进针3-4mm，接LD202H 型韩氏神经穴位刺激仪 （气海，左右天枢交替），连续波，波宽0.3ms，频率100Hz，电流强度1mA，每 日1 次，每次10 分钟，连续治疗7 天。 （2）标本采集 治疗结束后，大鼠24 小时禁食、不禁水，按照50mg/kg 剂量2%戊巴比妥钠 腹腔注射，待大鼠麻醉后，剖腹穿刺腹主动脉采血4-5ml，3000rpm 离心10min， 吸取上清液各 1ml，-20℃保存待测。而后取大鼠远端结肠 6-8cm 左右，沿肠系 膜纵行剖开，用预冷的4℃生理盐水冲洗后，肉眼观察黏膜损伤情况，并进行结 肠组织大体损伤评分。截取一段病变明显处组织，投入10%的中性缓冲甲醛溶液 固定并标记待测。 （3）大鼠结肠组织CCR7、SLC 蛋白表达及外周血TNF- α含量检测 采用免疫组织化学EnVision Plus 法，观察CCR7、SLC 蛋白在结肠组织的表 达部位，并进行半定量分析。采用ELISA 双抗体夹心法检测实验性肠炎大鼠外周 血TNF- α含量变化，并使用酶标仪测定吸光度 （OD 值）。 免疫组织化学En