针药结合治疗对DPN大鼠坐骨神经VEGF表达调节作用的实验研究.pdfVIP

糖尿病周围神经病变 （DPN ）是糖尿病的最常见的慢性并发症和主要的致残 因素之一。其主要临床特征为四肢远端（尤其下肢）对称性感觉、运动障碍及植 物神经功能障碍。病理以髓鞘和轴突发生退行性改变或脱髓鞘为特点。糖尿病患 者由于长期的糖代谢紊乱，高血糖导致粘滞度增加，血流缓慢，血小板聚集性增 加，血红蛋白糖基化，红细胞携氧和释氧能力下降，组织缺血缺氧，是刺激平滑 肌细胞分泌 VEGF 的重要结果，VEGF 在糖尿病周围神经病变中起了积极的作用 [1, 2] 。 1 材料 1.1 实验动物 选择健康雄性 Wistar 大鼠，80 只，鼠龄 4 个月，清洁级，体重 200～220 g ， 由中国科学院上海动物实验中心提供，动物许可证号码：SCXK(沪)2003 －0003 。 1.2 主要试剂 链脲佐菌素 （STZ，美国 Sigma 产品，批号 S-0130）；焦炭酸二乙酯 （DEPC ）， 上海生物工程技术公司；TRIZOLTM （上海生物工程技术公司）；FQ-PCR 试剂 盒 （达安基因公司）；VEGF （Santa Cruz 公司）。 1.3 主要仪器 低温离心机；紫外分光光度仪；PCR 仪（ABI7000, USA ）；IMS 细胞图像分 析系统（上海申滕信息技术有限公司）；医学图像分析软件（上海申滕信息技术 有限公司）；摄像机（PANASONIC ），显微镜（OLYPUS BH2 ），电针治疗仪 （G-6805II ）。 2 实验方法 2.1 糖尿病周围神经病大鼠模型建立 造模前大鼠禁食过夜，次日用STZ （STZ溶于0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲 液，冰浴中新鲜配制）按55mg/kg 剂量腹腔内一次注射（参照施新猷《医学动 物实验方法》）诱导糖尿病。1周后，用血糖仪测定尾尖血血糖，测血糖前禁食 过夜，血糖 ≥15mmol/L判定为糖尿病鼠。实验前监测血糖，血糖＜15mmol/L的 大鼠予以剔除。正常对照大鼠仅腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。 常规喂养 4W ，随机选取 10 只 DM 大鼠，进行血糖、体重和神经传导速度 检测，与造模前大鼠比较以空腹血糖≥15mmol/L、坐骨神经 SNCV、MNCV 明显 639 减慢及坐骨神经有髓纤维形态学改变，制备实验性 DPN 大鼠模型。 2.2 糖尿病周围神经病大鼠模型分组和针刺方法 （1）糖尿病周围神经病大鼠模型分组 造模成功后，按随机数字表法随机分为随机分为模型组、电针组、穴位注射 组和针药结合组，每组 15 只。正常组与模型组不作任何治疗，剩余大鼠备用。 （2 ）治疗方法 电针组：取穴：肾俞（双）、足三里（双）（穴位定位参照华兴邦的《大鼠穴 [6] 位图谱》 ），并接 G6805- Ⅱ型电针治疗仪，连续波，频率 2HZ ，电流强度为2 mA ， 1～3 V，每次20min ，隔日 1 次，共治疗 12 次。 穴位注射组：用雪莲注射液于上述穴位注射，每次轮换取 1 穴，每穴 0 ．1 ml， 隔日 1 次，共治疗 12 次。 针药结合组：电针+穴位注射。 2.3 指标检测 （1）运动神经传导速度检测 第一刺激部位在坐骨窝，第二刺激部位在踝部内侧，均用两个针电极经皮插 入，电极间距为 2mm，接地于尾部，保持皮温 30℃，用方形波（10～20mA ，40μs 脉波宽）刺激神经,用两个针电极在同侧的足部第二趾骨间肌记录复合肌肉动作 电位，记录 3 对不同 M 波的潜伏期，取平均值，近端和远端潜伏期作为运动神 经在两个刺激部位间的传导时间，用弯角规测量两个刺激部位间的距离。 （2 ）感觉神经传导速度检测 第一刺激部位在坐骨窝，第二刺激部位在踝部内侧，均用 2 个针电极在同侧 的足部第二趾骨间肌经皮插入，电极间距为2mm,接地于尾部。保持皮温 30℃， 用方形波（2mA ，40μs 脉波宽）记录 6 个在坐骨窝和踝部激发 H 反射潜伏期， 取最短潜伏期差值，用弯角规测量两个刺激部位间的距离。SNCV （m/s ）= 距 离/潜伏期差值。 2.4 样本采集及制备 治疗后，用 10%水合氯醛麻醉，在