香石竹设施栽培根际土壤微生物区系的16S+rRNA系统遗传多样性分析.pdfVIP

生物环境因素相同状态下的同地样本。按健康株组与枯萎病组(枯死)编号，分别采集植 株根系附着土装入自封保鲜袋，样品编号为健康株组YMJK41、YMJK42，枯萎病组 YMKW43、YMKW44，每组编号样本50一60株根系附着土混匀。 1．1．2主要试剂和仪器：配制培养基试剂均为国产分析纯试剂。dNTPs、Taq酶及扩增引物 等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。DNAMarker购自宝生物工程(大连)有限公 司。37℃恒温培养箱购自上海精宏试验设备有限公司。电泳仪购自Bio．Rad公司。PCR仪 购自德国Biotaetin公司。 1．2分离培养基 采用的分离培养基为：高氏一号琼脂培养基；酵母．麦芽膏琼脂培养基(ISP2)；甘油． 天门冬酰胺琼脂培养基(ISP5)；马铃薯浸汁培养基(PDA)；pH值为7．2．7．5。 1．3菌种分离 r／min摇匀30rain， 采用平板梯度稀释法，2．0 mL无菌水，室温、150 g新鲜土样加入20．0 使土样分散。取l111L加入9．0mL无菌水，连续稀释2次。取0．20 pL样品液均匀涂布在分离 培养基上。28℃培养30d，同一土样的分离培养基根据菌落形态、大小、颜色去重复后， 进行平板菌落计数、挑单菌落在ISP2琼脂培养基上画线纯化，纯化后菌株用于后续实验。 1．4分离菌株的基因组提取 1．4．1菌体总DNA的提取参照徐平等【l5】的方法进行。 1．4．216SrRNA基因扩增：16S 性5rain；95℃变性lrain；55℃退火1min；72℃延伸3 min(共30个循环)；72℃后再延伸lO m试。 1．5 16SrRNA基因测序及系统进化分析 16SrRNA基因的PCR产物由北京三博远志生物技术有限责任公司完成测序，测序所得 EzTaxonserver2．1软件在其生 结果用Blast软件在G饥B锄k／EMBL巾DBJ等数据库结合the 效发表种数据库中进行相似性搜索。选取同源性比较高的典型菌株的16SrRNA基因序列 作为参比对象，用Clustal．X软件进行多重序列比对，利用MEGA4．0软件，采用邻接法 (NeighborJommgMethod)进行聚类分析和系统进化树构建。 2结果 2．1香石竹根际土壤各类微生物区系差异 采用PDA，ISP2，ISPP5及高氏等培养基，分别对植株健康组和枯萎病组土壤中的微 生物进行培养分离，经纯化、形态去重复后共分离到109株菌。不同培养基的出菌率差异 5培养基25株，PDA培养基28株，高氏一号培养 不大，其中：ISP2培养基30株，ISP 基26株。从表1看出：植株健康组YMJK41和YMJK42土壤中微生物总菌株数分别为41 株、29株，植株枯萎病组YMJK43和YMJK44土壤中的微生物总菌株数则分别为32株、 7株；从真菌、细菌与放线菌的分布比例来看，植株健康组土壤中真菌与总菌株比例均低 于枯萎病株土壤，而放线菌占总菌株比例则相反，表现为植株健康组土壤高于枯萎病组土 壤，而细菌占总菌株数比例总体差异不大。无论是健康植株还是枯萎病株土壤，其真菌种 群均低于放线菌和细菌。因此，植株健康组与枯萎病组土壤中的三大类群微生物区系及其 比例方面，均有不同程度的差异性。 表1香石竹植株健康组与枯萎病组根际土壤微生物群落差异 in TablelThe ofMicrobial TheSoil and CarnationPlants discrepancy Populations ofHealthyBlight 2．2基于16SrRNA基因系统进化的细菌群落区系分析 对己分离得到的形态去重复的109株菌进行16(18)SrRNA基因测序，剔除重复序 列，构建基于16SrRNA基因的系统进化树(图1)。结果表明，己分离的98株菌(不含 真菌株)分布于细菌域中的4个门共15个属，并且植