里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造.pdfVIP

南方农业学报 JournalofSouthernAgriculture 2014，45(10)：1739-1743 ISSN 2095-1191；CODENNNXAAB http：Ilwww．nfnyxb．ell DOI：10．3969~：issn．2095～1191．2014．10．1739 里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbhl的分子改造 陈小玲 ·，张穗生 ，黄 俊 ，雷 富 ，陈 东 (广西科学院 非粮生物质酶解国家重点实验室／国家非粮生物质能源工程技术研究中心／广西生物质炼制重点实验室，南宁 530007； 广西科学院 广西近海海洋环境科学重点实验室，南宁 530007) 摘要：【目的】用分子改造的方法改造里氏木霉(Tfichodermareesei)的纤维二糖水解酶基因cbhl，提高其纤维素酶 活力，为工业化生产纤维素酶提供参考。 【方法】用DNaseI消化里氏木霉ebb1，回收100bp左右的片段后用T4DNA连 接酶连接，以连接产物作为模板进行PCR扩增，将PCR改造的cbhl基因转化里氏木霉原生质体 ，使改造的cbhl基因与 里氏木霉原有的cbhl基因发生同源重组。通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株，在NCBI上 比对分析突变菌株的cbhl序列。【结果】经克隆测序获得基因片段大小为637bp，与里氏木霉同属菌株cbhl基因的相似 性在88％~98％，确定为里氏木霉cbhl的基因片段。经DNaseI消化15min、T4DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后 的cbhl基因。将改造cbhl基因片段转化里氏木霉原生质体，得到cbhl基因突变体库。从cbhl基因突变体库中筛选获得 1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1．7518倍的突变菌株E 序列比对分析发现，与出发菌株相比，突变菌株E 的cbhl 基因有14个碱基发生了突变，其中5个碱基为置换突变 ，8个碱基为缺失突变，1个碱基为插入突变，分布于cbhl基因的9 个位置。【结论】改造后的cbh17~因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组，进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力。 关键词：里氏木霉；纤维素酶；纤维二糖水解酶基因；分子改造 ；碱基突变 中图分类号：Q785 文献标志码：A 文章编号：2095—1191(2014)10—1739—05 M olecularmodificationofcell0bi0hydr0lasegenecbhlfrom Trichodermareesei CHENXiao-ling，ZHANGSui-sheng，HUANGJun，LEIFu，CHENDong (1StateKeyLaboratoryofNon-FoodBiomassandEnzymeTechnology，GuangxiAcademyofScienceN／ationalEngineering ResearchCenterforNon-FoodBiorefinery／GuangxiKeyLaboratoryofBiorefinery，Nanning 530007，China；GuangxiKey LaboratoryofMarineEnvironmentalScience，GuangxiAcademyofSciences，Nanning530007，China) Abstract：【Objective】Molecularmodificationofcellobiohydrolasegenecbhlfrom reeseiwascarriedouttoim— provecellulaseactivityinordertoprovidescientificreferenceforcommercialproductionofcellulase．【Method】Cel— lobiohydrolase gene cbh