血管紧张素转换酶基因多态性分析与检测.pptVIP

酚的优点： 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点： 1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。 氯仿的作用： 克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量。（酚易溶于氯仿中） 血管紧张素转换酶基因多态性分析与检测 细胞与遗传学教研室 血管紧张素转换酶（ACE）是肾素-血管紧张素系统的关键酶。 血管紧张素是一组多肽类物质。其前体为血浆球蛋白，由肝产生，称为血管紧张素原。肾缺血、血钠降低或肾交感神经兴奋时，可刺激肾脏近球细胞分泌肾素(蛋白水解酶)，能使血管紧张素原水解成活性不强的血管紧张素I，血管紧张素I在肺与血浆中的ACE作用下形成血管紧张素II，后者在氨基肽酶的作用形成血管紧张素III。血管紧张素I对多数组织细胞无生理活性，血管紧张素II最为重要，它能广泛强烈的收缩血管，使外周阻力增加，血压升高。 血管紧张素转换酶（ACE） 血管紧张素转换酶（ACE）是肾素-血管紧张素系统的关键酶，也是人类心血管病理生理研究中最为多见的基因之一。 人类ACE基因定位于染色体17q23，全长21kb，包括26个外显子，在16号内含子上存在Alu片段插入型（insertion，I）或缺失型（deletion，D）多态性。 ACE基因: 1.掌握人外周血基因组DNA提取的基本原理与方法； 2.了解并熟悉PCR基本原理与试验方法； 3.学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； 4.掌握群体遗传学基因频率与基因型频率的计算方法。 实验目的 一、人血细胞基因组DNA提取 1.实验原理 实验准备 1、器材 离心机、离心管、记号笔、恒温培养箱、加样器、枪头、冰箱、水浴锅等。 2、试剂 2%EDTA抗凝剂、2×蔗糖裂解液、10%SDS、EDTA-Na2溶液、蛋白酶K、饱和酚、氯仿、TE缓冲液等。 3、材料 健康人外周血。 实验步骤 二、PCR扩增 Kary Mullis 乔治亚理工科大学毕业，加利福尼亚大学伯克利分校获得博士学位。1985年Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。由于当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶尚未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 是一种模拟天然DNA复制的体外扩增方法。 以拟扩增的DNA分子为模板，分别于上下游引物结合，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对原则加入相应的碱基进行延伸，重复这一过程，使目的DNA片段得到扩增。 Taq酶 催化DNA链合成反应. Taq酶是从水生栖热菌中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶. 对于PCR的应用有里程碑的意义, PCR循环的每一步对温度的要求都不一样, 多数酶在高温时即变性失活, 而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶, 使PCR技术变得非常简捷、且成本大大降低, PCR技术因此得以广泛应用. PCR反应步骤: 高温变性：94℃/95℃，双链DNA解开形成两条单链DNA，作为聚合反应的模板。 低温退火(复性): 55℃，引物和模板结合。 中温延伸：72℃，Taq DNA聚合酶以dNTPs为底物催化合成一条与模板互补的新链。 引物 各1μL Taq酶 dNTPs Buffer MgCl2 双蒸水 6μL 模板DNA 2μL 总体系 20μL PCR反应体系 Mix 10μL PCR反应条件 95℃ 4min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 30个循环 72 ℃ 30s 72 ℃