溶菌酶的晶体培养试验.doc

溶菌酶晶体培养实验 实验目的 近年来，X射线晶体结构分析技术在受体研究中得到了广泛应用。其关键是获得具有高衍射分辨率的晶体。本试验通过溶菌酶晶体培养实验： 了解蛋白质分子结晶的原理 了解影响蛋白质分子结晶的因素 掌握蛋白质晶体的悬滴培养法 蛋白质分子结晶的原理 蛋白质结晶的4个主要步骤： 测定蛋白质溶液的纯度 蛋白质溶液与盐，有机化合物等沉淀剂混匀；膜蛋白需要加入去垢剂 混合溶液达到过饱和状态，形成晶核 晶核一旦形成，晶体开始生长 三．影响蛋白质分子结晶的因素 1．待结晶蛋白质的纯度，一般要求纯度高于95% 2．待结晶蛋白质的浓度， 5~10 mg/ml 3．沉淀剂，盐，PEG，有机溶剂 4．pH值 5．温度， 4°C, 16°C 6. 结晶方法，悬滴法，坐滴法 7．震动 试剂及器材 试剂：溶菌酶蛋白，氯化钠，醋酸钠，去离子水 器材：可调移液器，晶体培养板，硅化盖玻片，真空脂，晶体培养箱，显微镜 试验步骤 配制50 mg/ml 溶菌酶溶液，0.1 M醋酸钠溶液，pH4.5 配制池液：（1）5% (w/v) 氯化钠，0.1 M醋酸钠溶液，pH4.5 （2）8% (w/v) 氯化钠，0.1 M醋酸钠溶液，pH4.5 3．在晶体培养板溶剂池中分别加入0.3 ml池液（1）和池液（2） 4．在干净的硅化盖玻片上，滴加2 ml溶菌酶溶液和2 ml池液 5．将盖玻片倒扣在加池液的有溶剂池上，用真空脂密封 6．将晶体培养板放入16°C晶体培养箱 7．第二天，在显微镜下观察晶体生长情况 Procedure for Crystallization of Lysozyme Chemicals needed: Lysozyme protein Sodium Chloride Sodium Acetate buffer Distilled water Procedure Prepare 50 mg/ml sample of lysozyme in 0.1 M NaAc pH4.5 Prepare well solutions: a. 5% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.5 b. 8% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.5 3. Place 0.3 ml of well solution a, well solution b in each well of a VDX tray 4. On a clean silated cover slide, create 4 drops of 2 μl lysozyme solution, 2 μl well solution 5. Seal these cover slips with grease over a well 6. Place the VDX plate in 16 °C incubator. 7. Observe the crystals next day under microscope