2荧光显微镜的基本原理.ppt

光学显微镜的基本参数 主要技术参数 数值孔径NA 荧光显微镜 * 多种研究显微镜的使用 参考实验书 ?p155-157倒置显微镜及荧光显微镜 ?p204 GFP有关内容 一、倒置显微镜(inverted microscope): 物镜、聚光镜等位置颠倒；物镜－聚光镜的工作距离较长，可将盛有样品的培养皿、培养瓶直接放置在载物台上进行观察。 二、体视显微镜(荧光) 三、荧光显微镜(fluorescence microscope)： 利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)，用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位置。 Figure 9-14 Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008) The maximum excitation and emission wavelengths of several commonly used fluorescent probes are shown in relation to the corresponding colors of the spectrum. The optical system of a fluorescence microscope. A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2) 荧光显微镜结构及性能特点 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。 ?荧光光源：高压汞灯 50－200W ?滤色系统 ?激发滤色片：置于光源与物镜之间，用于选择激发光范围，只有能激发荧光染料发光的特定波长的光通过。 ?阻挡滤色片：物镜和目镜之间，选择性通过特异的荧光，呈现专一的荧光色彩。 注意事项： 1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。 2 荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短时间内反复开关，标本应集中观察。） 4 载物台前方黄色遮光板：最好不直接用肉眼看激发光，以防短波光中的紫外伤害。 LEICA TCS- SP2 四、激光扫描共聚焦显微镜 The confocal fluorescence microscope ?a mitotic fertilized egg from a sea urchin (Psammechinus) was lysed with a detergent, exposed to an anti-tubulin antibody. Confocal microscopy produces an in-focus optical section through thick cells. 普通荧光显微镜下，存在许多来自焦平面以外的荧光，使观察到得图像反差和分辨率降低。 Confocal激光共聚焦扫描显微镜在某一瞬间只用很小的一束光激发，发出的荧光通过一个pinhole小孔/狭缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，来自焦平面以外的杂散光则被pinhole小孔挡住。所得图形更加清晰。 激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4-1.7倍。 When viewed by conventional fluorescence microscopy, the image is blurred. This blurring occurs because background fluorescence is detected from tubulin above and below the focal plane. The confocal microscopic image is sharp, particularly in the center of the mitotic spindle. In this case, fluorescence is detected only from molecules in the focal plane, generating a very thin optical section. ?The emitted fluorescent light passes through a pinhole that rejects out-of-focu