Ap-1基因siRNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移、分化及细胞外基质影响.pdf

·中文论著摘要· iRNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁 Ap-1基因S 移、分化及细胞外基质的影响 目 的 再狭窄是影响经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)远期疗效的主要障碍。尽 管血管成形术后的再狭窄机制目前尚不十分清楚。，但有很多因素参与，包括血栓 形成，平滑肌细胞增值和迁移，血管的弹性回缩，细胞外基质堆积弓|起的慢性重 构。每一环节都是治疗的关键。尸体解剖报告证明再狭窄一定程度上是内膜增生 引起的。平滑肌细胞增殖和迁移是动脉壁损伤和动脉粥样硬化的内膜形成的主要 机制。中膜的平滑肌细胞有较低的分裂活性，在动脉壁损伤和动脉粥样硬化的早 期阶段，各种生长因子刺激动脉平滑肌细胞由收缩型向合成型转变，并开始增殖， 引起动脉内膜增厚。平滑肌细胞由收缩型向合成型转变在血管疾病的发生机制中 起着关键作用。除生长因子的作用，平滑肌细胞增值和迁移还要求细胞周围的缨 脆强基质分解和再塑型，平淤胍细胞合成细胞外基质的重要成分包括胶原，弹力 蛋白，蛋白聚糖。在血管介入治疗损伤中，细胞外基质的积聚和分解的失调是内 膜增厚的主要原因，基质的再塑型要求蛋白水解酶的活动，其中基质金属蛋白酶 平滑肌细胞由中层向内膜迁移的时间过程相吻合。有研究显示，AP．1在球囊动脉 损伤中活性明显增加。 A P．1主要圭Jun弱Fos两大类蛋自质因子家族组成。Jun亚类中包括e．Jun、 s、Fo JunB、JunD；Fos亚类中包括c．Fo sB、Fral、Fra2等。Jun亚类成员可以 与任何AP．1家族因子结合形成同源或异源二聚体，或与另外一类含bZIP的转录激 s亚类只能和Jun亚类之间形成 活因子(ATF)家族形成Jun．ATF2异源二聚体；而Fo 异源二聚体。AP．1的DNA特舜性识别结合序列是只能被二聚体所介导。大量研究 p．差 显示，艘．1同DNA亲和力(或高或低)位点的存在，可能是莱一特定基因诱导A 结合的重要机制之一。因此，我们通过AP—lODN或反义C。Jun或反义C．Fos来降低A P．1总的DNA结合活性抑制平滑肌细胞增生，都取得明姓效果。抑制平滑肌细胞增 ODN被核 值的基因治疗作为PTCA术后减少狭窄的潜在方法。可是，体外用decoy 酸酶消忧问题没有解决。Stealth蹦RNAi克服了这一难题。 霹蓠，RNA于扰是最近发展超来憋一释快速关闭基因的薪方法。撂当细胞 导致蒸因沉默的现象，称为转录后基因沉默。由21-25个核苷酸组成的小片段干涉 RNA是RNAi过程中直接起作用的分子，细胞表现出特定缺失的表型。RNAi对染色 体DNA序列的复制和转录过程不产生任何影响。假设慕因沉默能使AP．1复合物的 腿绸胞，通过搦翻AP．1基嚣豹表达，检测VSMCs靛增蒲、迁移及去分化是否改变， 衄清刺激对AP一1基因沉默的VSMCs的作用有无相应的变化。 方法 l、采用组织块贴壁法行大鼠平滑肌细胞原代细胞培养，倒置显微镜下观察其 形态小鼠抗大鬣旺．SM．actin单克隧抗体免疫荧光鉴定。 AP。l基因序列无关的sil越NA作涛阴性对照(negativecontr01)．。把特异性siRNA序列 2000，转染Ap．1siRNA入平滑肌细胞。 LipofectamineTM Transwell和刮痕实验方法检测平滑肌细胞迁移情况， 5、用RT．PCR方法检测SM．a FV-500)下观察平滑肌缨 娃aetin的蛋皂的表达，免疫荧光共聚焦显微镜(Olympus 胞分化情瑟。 2 测MMP．2和u．PA的蛋白的表达，明胶酶谱分析MMP。2和MMP．9活性。 结果 差、阳性