应用454测序技术分析菌群结构方法学研究.pdf

Thesis for Master Degree, Shanghai Jiao Tong University The method study of the application of 454 pyrosequencing on microbial community analysis Author: Weiying Hua Supervisor: Professor Liping Zhao Major: Biochemistry and Molecular Biology Research Direction: Bioinformatics College: Life Science and Biotechnology Thesis period: 2007.9～2010.3 School of Life Science and Biotechnology Shanghai Jiao Tong University Mar, 2010 2 应用 454 测序技术分析菌群结构的方法学研究 摘 要 微生物以群落的形式广泛存在于自然界中。群落的组成决定其生 物功能。以 454 焦磷酸测序为代表的新一代测序技术凭借低成本、高 通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平 台。然而，如何更好地利用454 测序并进行后续的数据分析一直是广 受关注的问题。本研究从以下三个方面进行了探究。 首先在本实验室获取的真实数据基础上，模拟了分别由 16S rRNA V1-V2, V3 和 V6 区获取的 454 片段组成的菌群结构信息，并与 16S rRNA 全长序列获得的群落结构进行比较。结果显示，这些可变 区均能获得与全长序列相当的群落结构，但V6 区反映的微生物多样 性过高，和全长序列在属的水平上相关性较低。接着，在对现行 454 数据分析方法整合和改进的基础上，建立了一套包含序列质量控制、 序列比对、距离矩阵计算、操作分类单元划分、多样性分析、分类地 位鉴定和系统进化分析等步骤的分析流程。用该流程对真实的 454 测 序数据进行分析，得到了和 16S rRNA 全长序列相吻合的结果。同时 发现，样本平均测序量为 800 条时，各个分类水平上占主导的分类类 型（=5% ）表现出良好的可重复性，但低丰度的细菌（5% ）在科 和属的水平上的重复性和可靠性不佳。最后，将我们的分析流程和现 I 行的 454 分析方法，如 CVTree 和 BLAST-based 方法进行比较，结果 显示我们的分析流程获得的菌群结构和样本关系与 16S rRNA 全长的 结果更为相近。 关键词：菌群结构；454 高通量测序；454 测序的分析方法；重复性； 可靠性；CVTree 方法；BLAST-based 方法 II The method study of the application of 454 pyrosequencing on microbial community analysis ABSTRACT The microbioal communities exist in all parts of the biosphere. Their functions are determinded by the composition. The new generation sequencing technology such as 454 pyrosequencing provide new way for understanding of the diversity and comp