钠泵α2亚基M4-M5区的克隆、表达及单抗的制备及鉴定.pdf

㈣删㈣㈣㈣ Y1 目 录 900岑。芗芝。 中文摘要…………………………………………………………………………．．1 英文摘要………………………………………………………………………．4 研究论文钠泵砣亚基M4．M5区的克隆、表达及单抗的制备与鉴定 引言…………………………………………………………………………………………．．9 第一部分钠泵眈亚基M4．M5区蛋白的克隆、表达与纯化 前言………一………………………………………………………………………………．11日¨舌………“………………………………………………………………………………一11 材料与方法……………………………………………………………．12 制备与鉴定 摘 要 种特殊的膜结合蛋白，它在维持体内渗透压的平衡、稳定细胞膜电位、信 异源二聚体，其中0【亚单位是催化亚单位，它贯穿嵌入膜中，有10个跨 膜区(M1～MlO)，具有酶的活性和许多钠泵调节因子的结合位点，其中 四种亚型，各异构体间功能各异，具有种属特异性，近期的研究表明，钠 泵以亚基与高血压的发生和发展具有很大关系。本研究拟构建钠泵以 亚基M4～M5膜内区蛋白BB4．5的原核表达体系，表达并纯化目的蛋白， 体内的作用机制，及与疾病发生的关系奠定基础。 一、钠泵a2亚基M4．M5区蛋白的克隆和表达 目的：利用基因重组技术构建钠泵0【2亚基M4．M5膜内区蛋白的表 达载体，PTG诱导表达获得蛋白，通过蛋白纯化技术将蛋白纯化，为钠 泵以亚基单抗制备提供抗原。 接种表达菌，用终浓度为O．4 分析目的蛋白存在的形式，将包涵体变性和复性后，用Ni-NTA亲和柱进 行纯化，检测目的蛋白的纯度。(4)重组蛋白的W．estem blotting分析： 中文摘要 硝酸纤维素膜上，封闭，加入钠泵0【2亚基抗血清或抗His抗体，洗膜， DAB显色试剂盒进行显色，凝胶成像仪照相。 物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，在相应的位置出现明显的条带。将其加 尾后连接至pGM．T载体并转化入大肠杆菌DH5仅，挑选阳性克隆扩增并 提取质粒，双酶切和测序结果显示基因序列与理论一致。(2)将目的基因 在含胁的平板上筛选重组子。双酶切结果表明蛋白表达体系构建成功。 涵体形式存在，将包涵体用盐酸胍变性，梯度稀释复性后，用Ni-NTA亲 和柱进行纯化，得到纯度在90％以上的目的蛋白。(4)表达产物BB4．5 经Wbstem 厶 口。 结论：本研究成功的构建了钠泵眈亚基M4．M5蛋白表达载体 度在90％以上的目的蛋白，可作为抗原来制备钠泵以亚基单抗。 二、钠泵a2亚基单抗的制备与鉴定 目的：以钠泵以亚基M4．M5膜内区重组蛋白为抗原，免疫BALB／c 小鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法和免疫印 迹对单克隆抗体的特性进行和鉴定，为探明钠泵以亚基在体内的作用机 制，及其与疾病发生的关系奠定基础。 方法：(1)将以亚基纯化蛋白作为抗原，免疫6～8周BALB／c小鼠。 (2)通过杂交瘤技术来筛选砣亚基的单克隆抗体：取被免疫动物的脾细 (抗体分泌)细胞；将阳性细胞通过有限稀释法进行克隆化，直接获得可 稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，建株。(3)以小鼠腹水法制备杂交 瘤的粗制单克隆抗体，采用辛酸。硫酸铵沉淀法将抗体进行纯化。(4)采 用SigI】咂公司小鼠mAb Ig亚类检测试剂盒检测抗体的亚型。(5)采用 ELISA法测定抗体的亲和常数。 一一一 中文摘要 测出阳性孔有14孔，克隆化后得到两株效价较高细胞株。(3)小鼠腹腔 接种杂交瘤细胞