人C-反应蛋白的分离纯化及其初步应用.pdf

人 C-反应蛋白的分离纯化及初步应用 年级：2007 研究生:黄国团 导师：秦新民(教授) 蔡豪斌(副教授) 专业：生物化学与分子生物学 研究方向：酶与蛋白质化学 摘要 C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是人类最重要的急性时相反应蛋白之一，主要在 肝脏中合成。CRP 的正常合成速度为 1～10mg/d ，循环中的半衰期为 19h，在正常人群中 的浓度较低，新生儿为0.1～0.6mg/L ，成年人为0.4～5.2mg/L 。CRP 在炎症、感染、组 织损伤或恶性肿瘤等发生后的 6～8h 迅速升高，24～48h 达到峰值，急性期浓度甚至可以 升高成百上千倍，其升高的幅度与病情的严重程度呈正相关，且不会受到放疗、化疗、药 物等因素的影响。CRP 虽然不具有病种专属特异性，但是比 WBC 、IL-6 等传统的检测项 目更加灵敏可靠。 CRP 已经作为临床检测的常规项目之一，检测血清CRP 含量对许多疾病的早期诊断、 辅助诊断、疗效观察及判断预后具有重要意义。CRP 的测定方法主要有胶乳凝集法，放射 免疫法，免疫扩散法，免疫电泳法，金标法，酶联免疫法，免疫比浊法等。其中，免疫透 射比浊法发展十分迅速，能够在全自动生化分析仪上实现自动检测分析，应用越来越广泛。 目前，国内检测CRP 所使用的免疫透射比浊试剂盒以进口为主，价格昂贵，检测成本高， 在一定程度上限制了其推广应用。自主开发一种经济实用、性能可靠的 CRP 免疫透射比浊 定量检测试剂盒，具有十分重要的意义。 与单克隆抗体相比，多克隆抗体的亲和力更高，成本更低，制备方法更加简单，缺点 是制备时对抗原纯度要求非常高。兼顾试剂成本、试剂性能及技术要求，所以免疫比浊试 剂中的抗体多使用多克隆抗体。如果使用单克隆抗体则需要进行配对及胶乳增敏，技术要 求更加高。 商品抗原通常具有很好的性能，但是价格十分昂贵。鉴于 CRP 的重要性，为了满足研 究与生产的需要，本研究拟建立一种从临床血清样本中分离纯化人 CRP 的方法。自提CRP 初步应用于制备多克隆抗体，运用制备的抗体建立 CRP 免疫透射比浊定量检测方法。 方法： 1.对 CRP 单克隆抗体进行蛋白含量测定，效价测定，相对纯度分析和特异性测定。 2.从医院收集 CRP 高浓度(100mg/L)的临床血清样本，运用饱和硫酸铵沉淀总蛋白、 运用 DEAE 离子交换层析初步分离、运用制备的单克隆抗体亲和层析柱进一步精制纯化目 的蛋白，并进行鉴定。 3.以自提高纯度 CRP 作为抗原免疫山羊制备多克隆抗体，采用正辛酸-硫酸铵法进行 纯化，并进行鉴定。 4.运用制备的 CRP 多克隆抗体，建立 CRP 免疫透射比浊定量检测方法，并进行方法 学评价试验。 5.从医院收集临床血清样本，运用研制的试剂进行测定。 结果： 1.CPP 单克隆抗体的检测结果如下：蛋白浓度为 0.5mg/mL ，ELISA 效价为 1：2560 ， SDS电泳后凝胶扫描显示其相对纯度为96.2%，能够与商品 CRP 抗原发生特异性结 合。 2.从 2mL 临床血清样本能够分离纯化获得0.1mgCRP 。SDS电泳结果显示产物 中出现相对分子质量为23kD 的条带，凝胶扫描显示其相对纯度为 93.1%，能够与 CRP 单 克隆抗体发生特异性结合，与商品抗原有很好的可比性。 3.运用自提 CRP 成功制备出 CRP 多克隆抗体，纯化后抗体的总蛋白含量为 36.3mg/mL ，ELISA 效价为 1：256000 ，SDS电泳后凝胶扫描显示其相对纯度为 91.4%，能够与 CRP 抗原发生特异性结合。 4.运用制备的 CRP 多克隆抗体初步建立起免疫透射比浊定量检测 CRP 的方法。CRP 浓度在 3.1～150.0mg/L 范围内线性良好，检测限为 0.4mg/L ，重复性、稳定性及抗干扰 能力均比较好，与进口试剂有很好的可比性。 5.临床测定结果如下：健康体检组(n=50)CRP 浓度为 6.7±1.3mg/L ，风湿疾病组 (n=113)CRP 浓度为81.4±41.9mg/L ，两组结果存在显著差异。 结论：