G6PD缺乏症的分子筛查及与新生儿高胆红素血症的相关性研究.pdf

。 G6PD缺乏症的分子筛查及与新生儿高胆红 素血症的相关性研究 博士研究生：李亮 指导教师：徐湘民教授 摘要 葡萄糖．6．磷酸脱氢酶缺乏症是最常见的人类酶缺陷病之一，全世界范围内 约有4亿人受累，目前认为发病率较高的原因是由于疟疾选择的结果。因此该病 主要分布于疟疾高发的热带亚热带地区，从非洲热带、中东、东南亚到中国南方 地区、南美洲某些地区、亚洲热带和亚热带地区、地中海某些地区、巴布亚．新 几内亚，而新加坡、夏威夷等因移民原因也成为高发地区。G6PD缺乏症属X连 12个内含子，编码515个氨基酸。G6PD缺乏症的分子基础为G6PD基因的突变 导致生化表型的改变并产生临床症状。目前全世界已报道了160多种G6PD基因 突变型，大部分是单碱基改变的错义突变。患者中男性半合子G6PD活性显著缺 乏，女性杂合子酶活性变异范围较大，可显著性降低，也可在正常范围内。G6PD 缺乏症最常见的临床表现是新生儿黄疸和急性溶血性贫血，前者可以导致新生儿 核黄疸，从而影响新生儿智力。 G6PD缺乏症在我国主要分布在长江以南省份，广东、广西、海南、贵州、 云南、四川、台湾等省份，人群中基因携带率约为4-20％，男性发病率高于女 性。目前临床上检测G6PD活性方法主要是酶活性检测方法，由于女性杂合子酶 活性变异程度较大，该方法常常造成女性杂合子的漏检。本研究试图建立一种准 确、经济且适用于检测中国人的常见G6PD基因突变技术体系。此外，本研究还 探讨了G6PD缺乏症与新生儿高胆红素血症之间的相关性，研究结果将对G6PD 缺乏症的诊断以及新生儿高胆红素血症的预防提供新的诊断方法与有价值的遗 传学资料。 一、反向点杂交检测中国人常见G6PD点突变方法的研究 G6PD缺乏症为X连锁不完全显性遗传，根据莱昂假说，女性杂合子两条X 染色体会随机失活一条，所以女性杂合子酶活性有较大的变异度。目前临床上检 测G6PD主要是检测酶活性的生化检测法，所以会漏检表型较轻微的女性杂合 子，这部分杂合子患者虽然表型轻微，但依然有可能生出一个患病的男孩，而只 有分子诊断才能够准确的检测这部分患者，然而，目前存在的G6PD分子诊断方 中文摘要 法存在各种各样的问题，难以推广使用。因此，临床上迫切需要一种准确、经济、 且能同时检测中国人常见G6PD突变的检测方法。 中国人G6PD突变谱现已有25种，但占突变构成比绝大部分的是少数常见 突变类型。本研究将多重PCR与反向点杂交技术结合在一起，建立了一种准确、 经济，能同时检测中国人G6PD7种突变的方法。这7种突变类型分别是： c．1388GA，合计占整个突变构成比的85％左右。其基本原理和主要实验步骤如 下：反向点杂交技术检测点突变的基本原理是通过位于寡核苷酸探针中部的序列 特异性碱基与靶序列DNA的碱基配对和严格条件下洗膜来达到检测基因中少数 碱基变化的目的，探针5’端标记有氨基臂(-NH2)，与尼龙膜表面的羧基(．COOH) 进行化学反应而共价稳定结合。引物5’端标记了生物素，PCR产物扩增后，产 物片段末端即标有生物素，与探针杂交后，用酶标结合蛋白及其酶的底物即可获 得特异性杂交斑点信号(颜色反应)，根据显色探针的类型可知所分析标本的基 因型。首先，针对G6PD基因和7个突变点设计三对特异性PCR扩增引物和14 条特异性探针；然后，优化多重PCR体系以及反向点杂交体系；最后，确定最 终反应条件和引物及探针序列。多重PCR引物设计时，尽量使6条引物的Tm 值接近以使其复性效率相近从而达到在同一体系中扩增的目的。探针设计时，不 但要使探针Tm值接近，还要尽量使突变位点位于探针序列中部，以达到最大的 特异性效果。第一步，PCR扩增获得含有7个突变位点的三个G6PD基因片段。 第二步，将PCR扩增的产物加入10ml聚丙烯离心管中，管内有10ml的 置恒温水浴杂交仪中43．5℃杂交过夜。第三步，杂交完全后将膜条转移至另一离 分钟，之后又将膜条转移至另一离心管中(含10ml的2×SSC．0．I％SDS缓冲液)， 并加入59l酶标抗生物素链菌素蛋白，在室温下颠倒振摇15分钟，取出膜条并 用2×SSC．0．I％SDS缓冲液洗膜2