骨髓及骨髓基质细胞Leptin产生能力及意的研究.pdfVIP

摘 要 R0ckeⅡer大学的陆edm胁等用P0sitiond cloning法成功的克隆了作为鼠肥 胖病因的基因产物一IJepi衄，与希腊语kptos相关，即具有“瘦“的意思。 现在尚无中文译名，且称之为“瘦素”。最初的研究表明其主要由脂肪细胞 分泌，抑制摄食，增加能量消耗而抑制体重增加。此后的研究显示人的胎盘 组织也可产生，可能与胎儿的生长和发育调节有关。最近的研究证明Lep． 仅在下丘脑，也在脂肪组织、肝脏、生殖系统以及造血干细胞上表达，有人认 为Leptin对血液细胞的增殖和分化可能具有重要调节作用。体外研究显示 kpdn可单独促进红系造血细胞的增殖，与其它细胞因子结合可增加粒系 造血细胞的形成；体内研究表明鼠缺乏Leptin和其受体可引起造血功能减 低，这些结果促进人们去进一步研究Lepcin与造血的关系。但Le曲n对人 造血组织的作用如何?人骨髓中是否存在Lepcin?其来源于机体脂肪细胞 分泌后，经血液循环到达骨髓，作用于造血干细胞；还是作为能产生多种细 胞因子的骨髓也能产生Leptin，通过旁分泌作用于造血干细胞，迄今为止国 内外均无报导。骨髓中含有大量的骨髓基质细胞，主要由内皮细胞，脂肪细 胞，巨噬细胞，成纤维细胞等构成，是造血微环境的重要组成成分，可直接与 的方法首次报道了骨髓基质细胞在脂肪化条件下培养可以分泌kpIin。因 此，kptin这一新的细胞因子，可能具有多彩的生物活性和来源，探讨正常 机体及血液疾病状态下骨髓及骨髓基质细胞LeptiIl产生能力，具有重要的 科学价值和现实意义。为此j自1999年2月起，我们相继开始对正常人及 髓基质细胞Leptin表达能力及意义进行了系列研究。 方法：l、骨髓标本制备：用肝素抗凝采集骨髓标本后离心分离出骨髓 液，检测其kptin含量。同时分离出骨髓单个核细胞，一部分直接用于Lep一 与末梢血中Leptin浓度比(BM／PB)的检测。 3、骨髓基质细胞培养：用分离出的骨髓单个核细胞按硼dock—Witte 培养法略加改良进行骨髓基质细胞体外培养，并于培养后第一、二、三、四周 经时收集骨髓基质细胞，用于骨髓基质细胞LeptinmRNA的检测。 4、骨髓单个核细胞及骨髓基质细胞Lep血mRNA的表达及表达量利用 RT—PCR方法进行定性及定量检测：先进行RNA提取及逆转录。使用 ISoGEN试剂盒(日本株式会社≯一二／)，采取酚氯提取，异丙醇沉淀制备总 度。再用Superpre啪p1温cationsystem(GIBC0BRL)试剂盒逆转录RNA， 合成cDNA，于DNA鸭e珊al 用2％琼脂糖电泳凝胶法进行kp曲mRNA定性检测。 PRjSM7700 Detection Le面n定量PcR反应：应用ABI SeqLlence System 这种新的仪器，进行Leptin即时定量检测，也称之为新的即时定量PCR real一time (new quaIltitativePcR)。整个分析系统基于一个特殊标记的荧 光探针称TaqMar．探针和TaqDNA聚合酶的5’外切酶的分裂活性。TaqMan DNA聚合酶的57外切酶的作用，探针从靶上 在靶DNA上伸展时，由于Taq 分离，R荧光染色从Q荧光染色中释出，产生一个特异荧光信号被仪器立 即检出。靶DNA不存在或由于变异，TaqMan探针不能杂交时，R荧光染色 元变化。因此，R荧光强度与待测的目的基因成正比例。从而可以准确的 进行目的基因有无的判定，并定量出目的基因的最初拷贝数或浓度。新的 Se- PmsM7700 即时定量PCR时所用探针序列及LepIin特异引物由ABI Detec“on 靠ence System中的实验程序完成。．用已建立的Le—n标准曲线确 cDNA质量的内控制。实验 定检测结果，并用GAPDH标准曲线作为