加工番茄与ToV和CMV相关蛋白相互作用的初步研究.pdf

加工番茄与 ToMV 和 CMV 相关蛋白相互作用的初步研究 中文摘要 植物病毒侵入寄主植物并导致发病的能力与寄主和病毒相关分子间的相互 作用关系密切。这种相互作用直接影响病毒在寄主体内的复制，细胞间的运动， 系统性扩散，病症的轻重以及激发寄主产生抗病性等。目前已有研究证明，许多 寄主因子与病毒基因编码的蛋白，如外壳蛋白(coat protein ，CP) ，运动蛋白 (movement protein，MP)和复制酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase，RDRP) 发生相互作用，然而，这种在病毒致病性和寄主植物抗病毒相互作用机制尚未研 究透彻。酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种有效的方法。该系统能 迅速、敏感地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的互作，具有操作简便、灵敏 度高的特点，已在植物病毒学领域得到广泛应用。 在新疆近年来随着种植面积的扩大，栽培技术的调整，病毒的适应性变异等 因素的影响，加工番茄病毒病具有大面积爆发流行趋势，严重影响加工番茄的品 质，成为制约新疆番茄产业健康持续发展的重要因素。本研究选取对新疆加工番 茄危害较重的番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV) 和黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus,CMV)，分别选取 ToMV 的 CP 和 MP 基因以及 CMV 的2b 基因，通过 RT-PCR 扩增目的片段，分别将其构建到酵母双杂交诱饵载体 pSos 上， 获得了诱饵蛋白 pSos-CP、pSos-MP 和 pSos-2b 。将上述重组子分别单独转化到酵 母菌 cdc25H 中。结果显示：CP、MP 和 2b 三个蛋白对酵母菌 cdc25H 都未表现出 毒性和自激活活性。同时提取混合接种 ToMV 和 CMV 诱导的加工番茄叶片总 RNA ，通过 CytoTrap XR library construction kit 合成了双链 cDNA，之后用EcoR I 和 Xho I 双酶切将 cDNA 片段定向插入到表达载体 pMyr 中，转化受体菌 XL10-Gold ，构建了酵母双杂交加工番茄 cDNA 文库。文库质量鉴定表明：所构 6 9 建的初始文库滴度分别为 1.5×10 cfu/mL，扩增文库滴度为 3.0×10 cfu/mL 。文库重 组率均大于 98 ％，文库cDNA 插入片段长度大多集中分布在 700-2000bp 之间，表 明文库质量良好。抽提纯化文库质粒，分别将其与诱饵质粒 pSos-CP、pSos-MP 和 pSos-2b 共转化酵母菌 cdc25H 中，在 37℃半乳糖诱导下筛选可能与诱饵蛋白互 作的阳性克隆，经过氨基酸缺陷和温度限制筛选可能的阳性克隆。用不同的诱饵 初步筛选 cDNA 文库分别获得了不同阳性克隆：以 pSos-CP 为诱饵，从文库中筛 选获得 9 个阳性克隆；以 pSos-MP 为诱饵，从文库中筛选获得 28 个阳性克隆；以 pSos-2b 为诱饵，从文库中筛选获得 7 个阳性克隆。通过 PCR 鉴定阳性克隆子中 cDNA 插入片段的大小和酶切验证后测序。在NCBI 数据库中对测序结果进行Blast I 分析，根据数据库中阳性克隆对应同源序列的相关信息，对相同的克隆进行分类 合并。该试验结果还有待于进一步的验证分析。 本研究首次利用酵母双杂交系统从加工番茄 cDNA 文库中筛选了可能与 ToMV CP、MP 和 CMV 2b 具有互作关系的寄主基因，为进一步验证相关抗病基 因及其编码蛋白的功能，研究加工番茄与 ToMV 和 CMV 互作机理及培育抗病毒 加工番茄种质资源新材料奠定了基础。 关键词：加工番茄；黄瓜花叶病毒；番茄花叶病毒；酵母双杂交；抗病基因 II