微生物转化合成’-脱氧腺苷.pdfVIP

摘要 2，_脱氧腺苷(dAR)是天然的脱氧核苷，天然的核苷类物质与生物生命活动密不 可分，并且其有一定药用价值，可抑制胰岛素分泌。近年来dAR作为一种合成抗肿 瘤、抗病毒核苷类化合物的中间体受到越来越高的关注。传统的生产脱氧核苷类物质 的方法(核酸酶水解法)局限于有限的天然资源(主要从大马哈鱼卵中分离)，并且 分离提取纯品困难，化学合成法合成27．脱氧腺苷又存在步骤复杂、异构体不好分离、 转化率低、原料成本高、污染环境等问题，而利用微生物核苷磷酸化酶的高选择性生 物转化合成2’．脱氧腺苷是一种理想的方法，目前已成为核苷类药物合成研究的研究热 点。 论文对27．脱氧腺苷快速定性定量的测定和分离做了系统研究。建立了纸层析．分光 光度法用于测定生物转化液中脱氧腺苷含量。用不同极性的展开剂进行纸层析分离转 化体系中脱氧腺苷产物，分光光度法测定分离的脱氧腺苷浓度。测试了4种展开剂对 脱氧腺苷的分离效果，发现用展开剂I(正丁醇：冰乙酸：水=6：1：3)和II(异丙 醇：氨水：水_17：‘2：1)进行双向纸层析可将脱氧腺苷与其它成分分离，用展开剂IV (正丁醇：异丙醇：氨水：水=3：3：2：2)一次层析可将脱氧腺苷产物与其它成分分 离。将分离的脱氧腺苷层析样点剪下并重新溶解后在258am处测定其吸光值，根据标 准曲线即可计算出转化反应液中的产物浓度。用展开剂Ⅳ进行纸层析可将脱氧腺苷分 离，迸一步用分光光度计可测定其含量，该法与HPLC法一致，符合率达99．4％以 上，是一种简易有效的测定生物转化体系中脱氧腺苷含量的快速方法。 ．论文进一步研究了利用大肠杆菌菌株的游离细胞进行生物转化合成脱氧腺苷试 验，用纸层析法证明转化合成是成功的，有产物脱氧腺苷的合成反应发生。在此基础 上对转化反应条件进行分析，建立了胸苷与腺嘌呤为底物的生物酶促转化合成27．脱氧 腺苷的反应体系，结果显示，最适转化反应温度为57℃，最适反应时间为4h，磷酸 mmol／L，反应底物胸苷和腺嘌呤最适浓度分别 钾缓冲液最适pH值为7．5、浓度为150 mmol／L、65 为54 mmol／L，胸苷转化率为56．2％。2’．脱氧腺苷的分离则采用离子交换 柱与纸层析相接合的方法，解决了产物与底物间结构相似，不易分离的缺点。并通过 多种鉴定方法(显色法、高效液相色谱法、液质联用、红外光谱法、核磁共振法)对 所分离的合成产物进行鉴定，结果显示合成产物为2’．脱氧腺苷。 关键词：2’．脱氧腺苷，生物转化，核苷磷酸化酶，大肠杆菌，纸层析．分光光度法 II ABSTRACT isanaturalnucleosidewhichare from life it 2-Deoxyadenosine inseparrablebiologicalactivities，and medicinalvalueofinhibitionofinsulin has hasthe extraordinarystrong secretion．2-Deoxyadenosine asa intermediate ofanti-cancerandanti—viralnucleoside a∞ potentials compound drugs．Nucleosides nuturul nuclease isrestrictedtolimited resource(minely traditionallypreparedby hydrolysis，which difficultiesinisolationof chemicalmethods of2，． isolatedfromsa