两种α-淀粉酶因克隆表达及分子改造.pdfVIP

两种不同特性的0【．淀粉酶基因克隆表达及分子改造 摘要 淀粉酶是已商业化且应用最广泛的酶制剂之一，随着淀粉应用范围的 不断扩展，对淀粉酶的酶学性质要求会越来越多、越来越专业化以适应不 同类型的反应。发现和改造获得更多的具有特殊性质的酶资源，为淀粉酶 的工业化应用提供必要的前提条件。 本研究从自然界筛选到两株高产淀粉酶的野生菌株，初步鉴定为链霉 sp．)和芽孢杆菌属菌株(Bacillussp．)，分别命名为GXT-6 菌属(Streptomyces 和G)(BA一4。利用简并PCR成功地从菌株Streptomycessp．GXT-6的基因组 DNA中克隆到一个0【．淀粉酶基因，并在大肠杆菌成功表达。通过酶学性质 研究，该酶的最适温度为55 检测其水解淀粉产物主要为麦芽糖、麦芽三糖以及麦芽四糖，不含有葡萄 糖，在麦芽糖浆生产工业上有很大的应用前景。 利用超滤，凝胶过滤和硫酸铵沉淀等方法从野生菌Bacillus sp．GXBA．4 的发酵液中分离纯化到单一的0c一淀粉酶组分，利用质谱技术(MS)测定该 酶的部分氨基酸序列，从而成功的克隆至lJBacillus O【．淀粉酶基 sp．GXBA．4 因，并成功表达。通过酶学性质研究发现，该酶的最适温度为40。C．45℃， 最适pH为5．0，产物为葡萄糖、麦芽糖及麦芽三糖等多种低聚糖混合物，是 一种偏低温酸性cc．淀粉酶，在食品和淀粉加工行业将有一定的应用前景。 本研究以已有三维晶体结构的Bacillus amyloliquefaciens 预测，对Bacillus 比活力下降了20倍，P362Y下降了1倍；对突变酶进行酶学分析，其最适温 s 提高和降低T P362E和P362Y水解淀粉生成葡萄糖的量略有减少。 关键词：麦芽糖仅．淀粉酶酸性仅．淀粉酶蛋白质纯化定点饱和突变 酶学性质 AND MOLECULAR CLONING，EXPRESSION OFTWOALPHA．AMYLASEGENES ABSTRACT hadbeencommercializedandwasoneofthemost used Amylase widely the of demandsof enzymes．Withexpandingscopestarch’application，the of need kinds becamemoreandmore thusthere special amylases obvious，and tobemore withvarious characterizationstomeetits amylases specific to andtransformmore expandingapplications，it’Sbadlynecessarydiscovery resourcesfor the toindustrial amylase providingnecessarypreconditions applications． Inthis wild