双歧杆菌原生质的制备及serpin缺失株的构建.pdfVIP

摘要 41610 Y21 摘要 inhibitor)是一种多肽类丝氨酸蛋白酶抑制剂的总称， Serpin(serine protease 由350至500个氨基酸组成。2006年研究发现长双歧杆菌的菌体表面存在着 Serpin，能够保护菌体抵抗外源蛋白酶的消化，为其粘附定植肠道提供前提条件。 目前，Serpin蛋白对双歧杆菌物质代谢，繁殖扩增等方面的影响不甚清楚。在 前期研究中，本实验室筛选到一株产Serpin蛋白的婴儿双歧杆菌，证实原核克 隆表达的Serpin蛋白能有效抑制糜蛋白酶和胰弹性蛋白酶的活性，并促进双歧 ’杆菌体外粘附细胞；本研究拟通过导入置换型打靶载体，构建基因缺失株的方 法，进一步研究表面蛋白Serpin的功能。然而由于双歧杆菌的细胞壁过厚，外源 基因导入困难，导致转化效率极其低下，因此本研究一方面要获得高活力的双歧 杆菌原生质体，另一方面通过原生质体转化及同源重组获得serpin基因缺失株。 双歧杆菌原生质体制备的文献报道甚少，本文分别评价了多种因素(生长状 态、酶解浓度、时长、温度以及不同渗透压稳定剂等)对长双歧杆菌原生员体制 备的影响，获得了长双歧杆菌WBL001原生质体制备及再生的优化条件：菌体 处于对数中期(OD600为2．0)，以棉子糖溶液(SMlVl)为原生质体稳定液，5mg／L min，原生质体生成率和再生率分别达到81％和48％， 变溶菌素，37℃孵育30 目前报道中革兰氏阳性菌的原生质体再生率在30％左右。 在此基础上，通过原生质体的PEG介导转化，将构建的双歧杆菌serpin的 置换型打靶载体UPD导入双歧杆菌，成功构建了serpin缺失株，并对缺失株的 体外细胞粘附能力进行了分析研究，发现serpin缺失对双歧杆菌的黏附没有明 显影响。 综上所述，本文通过构建原生质体转化体系，成功实现了serpin的敲除，为 研究益生菌的功能蛋白提供了方法学参考。 关键词：双歧杆菌；Serpin；基因敲除；原生质体 A8STl敞C， ABSTRACT the termof serine inhibitor)is Serpin(serineprotease general peptide—like of350-500aminoac迅．In2006theSwissNestle pmteaseinhib赋consisting ResearchCenterfoundthat from it Serpintt．10ngumprotectedagainstexogenous andthus fortheadhesioninintestinaltract。 proteolysis providedpre-conditions effectof onhost isnot byBifidobacteria Recently,thebiological serpin completely clear．In WBAN07姒th was 01Mpreviousstudy，投infantis Serpin-likeprot