海洋球石藻病毒Coccolithovirus)丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)基因克隆、表达及其与宿主神经酰胺合成之间的关系.pdfVIP

基因克隆、表达及其与宿主神经酰胺合成之间的关系 摘 要 地高纬度海域中具有重要生态功能的优势浮游植物类群，也是该海域大面积赤潮形成种， 因其独特的生物矿化作用和高产二甲基硫丙酸(DMSP)能力己成为影响全球碳、硫生物地化 循环及气候变化的一个关键指示种。同时球石藻因其能够产生丰富的次级代谢生物活性物 质而在生物技术研究领域也具有广阔的应用前景。球石藻Emiliania huxleyi赤潮消亡己被 证实是由于病毒裂解所致，并且普遍认为在该病毒感染过程中伴随着宿主细胞神经酰胺类 中罕见的单链丝氨酸棕榈酰转移酶(serinepalmitoyl 一限速酶。因此推测，球石藻病毒感染导致宿主细胞中神经酰胺的积累过程可能受控于病 毒SPT基因的表达。究竟病毒感染是否与宿主神经酰胺合成之间具有内在的相关性及其机 制如何尚不清楚，如果它们之间被证明确实存在一定的关系，那么球石藻病毒作为一种天 然载体，通过感染宿主是否可为神经酰胺的生产开辟一个新途径昵?因此本论文拟以海洋 球石藻及其特异性病毒为研究对象，采用分子生物学方等法研究病毒感染与宿主神经酰胺 合成之间的关系。 端的催化亚基LCB2在大肠杆菌中进行重组表达并对表达产物进行细胞内活性分析；建立 Performance 高效液相色谱法(High Liquid 经酰胺的含量；通过荧光定量PCR(Real．timePCR)和Westernblot技术分别从转 quantitative 录水平和翻译水平分析病毒感染不同时期其SPT基因表达水平与宿主神经酰胺合成之间的 关系。通过以上内容的研究，查明该病毒SPT基因表达与宿主神经酰胺合成之间是否具有 一定的相关性及其特点，为进一步以该病毒和宿主为材料开发天然神经酰胺产物奠定基 础。本论文的主要研究结果如下： 化和结构亚基，由这2个亚基组成该酶的三级结构与a．酮胺合成酶(AOS)家族成员高度类 似。 coli BL21中进行诱导表达， (2)构建了pGEX4T-3／EhV9981一LCB2表达载体并于E 获得分子量为78．2 kDa的重组蛋白。通过薄层层析法(Thin．1ayer coli 重组蛋白在E BL21细胞中表达产物进行鉴定，发现重组蛋白能够引起大肠杆菌细胞 中新鞘脂类物质的积累。表明重组EhV9981．LCB2具有一定的催化活性。 以正己烷．乙醇(99：1)作为极性流动相用于样品神经酰胺的分离和检测，以此条件获得仪器 (4)运用实时荧光定量PCR技术、Western 后的1．5、6、12、18、24、30和36 h，SPT基因的转录水平呈现上升趋势，而在12．24h之间呈下降趋势 关系。发现在1．5．12 并在24h下降到最低水平，仅为初始转录水平的63．4％；在随后的30和36h则升高并达 h之间呈下降趋势并 到最高水平，为初始转录水平的5．383倍。SPT蛋白表达水平在6．18 在18h降到最低，为初始表达水平约60％；而在18．30h之间SPT在翻译水平上的蛋白表 达开始上升并在感染后的30h达到最大值，为初始值的1．06倍，随后又逐渐下降。以上 h之间，病毒感 结果表明，SPT基因在转录和翻译水平上的时序变化是不同步的。在O一18 染组NFA．Cer的含量发生逐渐的积累，在24．30 h之间，感染组PS-Cer含量逐渐的增加并在 肛∥l的最高值，为对照组的2．24倍。在O．12 12．24 h h之间稳定于47．3