碱性蛋白酶产生筛选及其apr基因表达与酶学特性研究.pdfVIP

摘要 本研究从环境分离到一株碱性蛋白酶产生菌，通过形态特征、生理生化和16S rRNA基因序列分析确定菌株的分类地位，并采用正交试验设计探讨其发酵改良血粉 和豆粕饲用品质的效果，同时构建其碱性蛋白酶基因的表达质粒，对重组质粒表达条 件和特性进行研究，并探索重组酶的部分酶学性质。 1．碱性蛋白酶产生菌的分离和鉴定。为了筛选碱性蛋白酶产生菌并探讨其对蛋 白质饲料的发酵效果，以肉粉厂表层土壤为菌株分离源，利用脱脂牛奶培养基分离和 纯化蛋白酶产生茵，通过形态特征、生理生化和16S蝴基因序列分析确定菌株的 分类地位，此碱性蛋白酶产生菌与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近，同源性为99．5‰故 命名为枯草芽孢杆菌D．2。 h、24h和 究筛选出的优势菌种的接种量(3％、6％和12％)、种子液培养时间(12 48 h、24 h)和固态发酵时间(12 h和48 h)3因素对发酵豆粕和血粉的影响。结果 表明，其最优条件为接种量6％、种子液培养时间24h和发酵时间48 h，在最优条件 下，该菌固态发酵豆粕及血粉可显著增加小肽含量至17．06％和12．73％。枯草芽孢杆 菌D-2(鼢cfⅣ淞J“6川括s岫l D．2)所产的碱性蛋白酶能高效降解豆粕和血粉中的蛋 白，提高豆粕和血粉的饲用品质。 3．枯草芽孢杆菌D-2碱性蛋白酶基因的克隆．、表达。为了建立高产的枯草芽孢 杆菌碱性蛋白酶基因表达体系，采用PCR方法从枯草芽孢杆菌D．2中扩增等到碱性 鉴定后，转化至大肠杆菌BL21构建成重组工程菌，并对该基因和编码蛋白进行同源 性比较和诱导表达条件的研究。结果表明，碱性蛋白酶基因序列全长1149 bp，编码 382个氨基酸，SDS—PAGE显示融合蛋白分子质量为60．4 kDa。在诱导剂异丙基．D．D． 硫代吡喃半乳糖苷浓度O．2 mmoⅥ。，诱导时间为4 h，重组工程菌在27℃表达产物主 要以可溶形式存在，37℃主要以包涵体形式存在。可溶性表达产物经测定具有碱性蛋 白酶生物活性。 4．重组菌碱性蛋白酶纯化及其酶学性质研究。为了研究重组酶盐析特性和酶学 性质，发酵液经硫酸铵分级盐析和透析除盐纯化得粗酶并研究不同温度、pH条件和 金属离子、化学试剂处理下的酶活。盐析曲线表明在硫酸铵浓度60％时发酵液中重组 酶几乎完全析出，酶学性质研究表明该重组酶的最适反应温度为50℃，最适pH为 lO．5，具有较高的热稳定性，在pH 对酶都有一定的激活作用，而Hg+、Ag+对酶有明显的抑制作用，苯甲基磺酰氟 (PMSF)和二异丙基氟磷酸(DFP)对该酶具有强烈抑制作用。 Sen，er程序、scralch proteiIl №ItlUIlP Predi嘶on 1．O程序、CBS 程序等，对核苷酸序列、碱基同源性和开放阅读框进行了分析，并将核酸序列翻译为 氨基酸序列，预测和分析了蛋白质的一级结构、二级结构和三级结构，包括氨基酸序 列分析、信号肽预测、疏水性分析、跨膜区分析、亚细胞定位、结构域预测和空间结 构预测。结果表明，此蛋白酶的信号肽位置为前30个氨基酸的肽链，疏水性较高， 含跨膜区，第3肚382个氨基酸的肽链为胞外区，为分泌型蛋白酶，含有n螺旋、B 折叠、p转角等结构域，并预测出了其空间结构。 关键词：碱性蛋白酶，枯草芽孢杆菌，克隆表达，酶学性质，蛋白质结构 II 1咖吣哪Ⅲ砌哪舢Ⅷ圳帅