用于气味分子丁二酮检测嗅觉受体蛋白ODR-10异源表达及研究.pdfVIP

用于气味分子丁二酮检测的嗅觉受体蛋白oDR-lo异 源表达的研究 浙江大学医学院 生物化学与分子生物学专业 09级硕士研究生 彭 鹤 导 师 赵鲁杭 中文摘要 生物的嗅觉系统能识别和区分成千上万种不同的气味分子，具有很高的灵敏 度和特异性．嗅觉和视觉、听觉一样，对大多数动物的生存具有重要的意义．生 物界中大多数有机体依赖嗅觉进行觅食、躲避天敌和交配等．自从嗅觉受体基因 超家族首次被发现并克隆，嗅觉感知机制被阐明以来，人们对嗅觉的研究越来越 。 感兴趣． 嗅觉感知，以哺乳动物为例，起始于嗅觉受体蛋白与气味分子的结合，受体 配体结合物激活细胞内G一蛋白，引起细胞内发生一系列的生物化学级联效应，细 胞产生动作电位，将气味分子的化学信号转导成动作电位的电信号，通过轴突把 嗅觉信号传导到嗅球，经过加工和修饰，输入到大脑皮层的嗅觉信号处理中枢， 在这里完成嗅觉信号的解码，从而形成对气味的感知，实现气味的识别和辨别． 嗅觉受体蛋白在气味感知过程中起着重要的作用，它属于G．蛋白偶联受体超 家族，有7个跨膜区域．而嗅觉受体基因不含N．末端信号肽序列，当克隆的嗅觉 受体基因在异源细胞系统中表达时，翻译后的蛋白因缺乏信号肽的引导，在内质 网内滞留、聚集，甚至在蛋白酶的作用下降解，最终无法定位在细胞膜上．这也 是目前研究嗅觉受体蛋白异源表达的热点之一． 随着嗅觉感知机理的阐明，人们通过模仿嗅觉系统识别和分辨气味的机理， 以生物活性组分，如嗅觉受体神经元、嗅觉受体蛋白等作为识别元件，结合各种 二级传感器，构建了多种仿生嗅觉传感器．仿生嗅觉传感器具有灵敏度高、响应 n 速度快、选择性好等特点，可广泛应用于生物医学、环境监测、药物开发、食品 和水源质量控制等诸多领域，具有潜在的工业应用前景和商业价值。同时仿生嗅 觉传感器也为嗅觉传导机理的深入研究提供了新的技术手段，如用于鉴定特异的 嗅觉受体．配体对、研究嗅神经元对刺激的响应特性、细胞电生理等，从而促进嗅 觉传导机理的研究． crystal 石英晶体微天平(q嘣z microbal锄ce，QcM)是一种质量敏感型传感器， 其检测谐振频率的改变△f与传感器表面的质量变化△m成线性关系，因而作为一 种灵敏的检测手段被广泛用于生物微质量检测。近年来，该类传感器结合生物特 异性识别材料构成生物传感器，实现了细菌、蛋白、小分子的微量变化差异的检 测。 研究目的： 通过分子生物学的方法构建线虫嗅觉受体基因od卜10真核表达载体，在异源 器提供识别元件一嗅觉受体蛋白． 研究方法： 将含有11is标签和rho信号肽的序列插入到od卜10基因的N．端，并将其克隆 到真核表达载体pcDNA3．1(+)中，得到重组质粒．通过脂质体法将重组质粒转染 blot方法检测 到HEK．293细胞中．转染48h后，分别利用逆转录PCR和westem 目的基因和蛋白在细胞中的表达情况．细胞免疫荧光的方法检测目的蛋白在细胞 质膜上的定位，之后运用钙离子成像实验，验证表达蛋白是否具有识别特异性气 味配体的生物活性．最后提取目的蛋白，将其固定在生物传感器QCM电极的表 面，通过添加不同气味刺激，检测蛋白的活性及验证仿生嗅觉生物传感器的功能． 研究结果： 通过双酶切及测序鉴定结果显示成功构建了真核表达载体 说明目的蛋白在RNA水平有表达，同时W．estemblot结果显示目的蛋白在细胞中 有表达．细胞免疫荧光实验也证实目的蛋白表达在细胞质膜上．钙离子成像实验 通过激光共聚焦显微镜的观察，结果显示在添加刺激时细胞内荧光增强，说明目 的蛋白能识别其特异性配体丁二酮。QCM传感器检测结果显示提取的目的蛋白 具有识别气味配体的生物活性，基于嗅觉受体蛋白ODR．10的QCM生物传感器 能特异性地识别气味分子． 研究结论： 成功的在异源细胞系统HEK．293细胞中表达了线虫嗅觉受体蛋白ODR．10， 基于OD