PIG11基因逆转录病毒载体的构建及其高表达对HepG2细胞凋亡的影响.pdf

PIG11 基因逆转录病毒载体的构建及 其高表达对HepG2 细胞凋亡的影响 硕士研究生：吴 艳 导 师：梁 晓 秋 教授 中 文 摘 要 目的：构建人PIG11 逆转录病毒载体，建立高表达 PIG11 基因的 HepG2 细胞株，为进一步研究PIG11 基因在肝癌细胞中的功能及促凋亡作用提供一个理 想的试验平台。观察PIG11 基因高表达对HepG2 细胞凋亡的影响。 方法：将已有的pcDNA3.1/NT-GFP-PIG11 质粒用PCR 法扩增出PIG11 片 段，经过酶切、T4 DNA 聚合酶连接等步骤将该片段重组入pLXSN 逆转录病毒 载体中，构建含人PIG11 cDNA 的重组质粒pLXSN-PIG11 。重组载体经PCR 鉴 定和DNA 测序分析。将该重组质粒用lipofectamineTM2000 转染包装细胞PA317 ， 获得pLXSN-PIG11 逆转录病毒液。用病毒液感染NIH3T3 细胞，检测病毒滴度。 再用病毒液感染HepG2 细胞，G418 筛选，获得PIG11 高表达的HepG2 细胞株。 应用RT-PCR 和Western Blot 检测经感染后HepG2 细胞的PIG11 表达。对成功感 染PIG11 基因的HepG2 细胞应用HE 染色、DNA Ladder 以及流式细胞仪检测等 方法测定PIG11 在HepG2 中高表达时对该细胞凋亡的影响。 结果：成功构建了pLXSN-PIG11 逆转录病毒载体，测序证明PIG11cDNA 编码序列与GenBank 中报道的一致。转染PA317 细胞后病毒释放，经检验病毒 5cfu/ml 。用含病毒上清液感染HepG2 细胞，经RT-PCR 和Western Blot 滴度为1×10 检测证实HepG2 细胞中PIG11 mRNA 及PIG11 蛋白表达明显升高。高表达PIG11 的HepG2 细胞从形态学上可观察到凋亡细胞增多，有明显的DNA Ladder 条带。 流式细胞仪检测显示感染PIG11 的HepG2 细胞凋亡率为41.13% ±2.29% ，明显 高于未处理组细胞的凋亡率 3.33% ±0.81%和感染空载体细胞的凋亡率 3.53% ± 4 0.40% ，且差异有显著性（P0.01 ）。 结论：成功构建了逆转录病毒载体pLXSN-PIG11 ，获得稳定高表达PIG11 蛋白的HepG2 细胞株；PIG11 蛋白高表达能明显促进HepG2 细胞凋亡。 关键词：PIG11 ，逆转录病毒载体，HepG2 ，凋亡 5 Recombinant PIG11 Gene Retroviral Vector Construction and the Induced Apoptosis Effect of Its High Expression in HepG2 Cells ABSTRACT Objective: To construct the human PIG11 gene retroviral vector and obtain a HepG2 cell line high expressing PIG11gene by infection, which can be used for the further research on the function of PIG11 gene in liver cancer cell and the role of which to promote apoptosis. Explore the effect of high expression PIG11 gene can induce HepG2 cells apoptosis. Methods: Am