蛋白组高通量、高效、高灵敏分离分析新技术与新方法的研究.pdf

复旦太学博士论文 摘要 蛋白组学的研究方法，主要依赖于分离分析技术和检测技术的突破性发展。 2D PAGE是最通用的蛋白组分离方法，它结合了等电聚焦和体积排阻两种分离机 PAGE也存在一些难以克 理正交的分离方法，对蛋白有很高的分辨能力。然而2D 服的缺陷，比如有限的动态范围，分离样品中分子量差别较大的蛋白、低拷贝蛋 白(如信号蛋白和转录因子)、疏水蛋白(膜结合蛋白和跨膜蛋白)以及极酸极碱蛋 白时仍然存在许多难以克服的问题，对操作者的技术要求高，难以实现与质谱(Ms) 的直接联用等。寻找2DE的替代技术为全球生物分析工作者所关注。 传统色谱或电泳分离技术由于蜂容量有限，对于组分异常复杂的体系如蛋白 组，分离能力有很大的局限性。发展两维乃至多维色谱一电泳分离技术，是根本上 解决问题的方法。从理论上说，只要组合在一起的两种模式分离机理正交，整个 二维系统的峰容量是每一维峰容量的乘积，特别适合于复杂样品的分析。在过去 的十年中，已经出现了一些被认为是突破性的进展，Jorgenson(多维色谱一电泳 学新方法的研究方面打开了一个崭新的局面。 本论文以多维色谱一电泳分离方法为主要方向，系统地研究了本工作涉及到 等分离方法和激光诱导荧光检测技术(LIF)、阵列分离技术以及全柱成像检测 三维分离系统，设计并制作了受专利保护的用于大数量毛细管阵列的全柱成像激 光诱导荧光检测器，将此多维系统应用于酵母蛋白组和肝肿瘤组织蛋白组等样品 的分离，得到了令人满意的结果，证明了多维色谱一电泳分离系统超强的分离能 力和广阔的应用前景。另外还研制了一台单点式激光诱导荧光检测器，能进行芯 片、毛细管的单点或扫描式全柱检测以及阵列检测。 本论文共分六章，主要内容如下； 论文第一章总结了二维／多维色谱一电泳分离领域的研究进展。介绍了二维／ 多维分离方法的理论依据，详述了以IEF分离模式为基础的多维分离方法。探讨 了多维分离模式的成功与不足，同时总结了毛细管阵列分离和全柱成像检测技术 VII 复旦大学博士论文 的进展。并介绍了本论文选题的目的和意义，着重在于改进多维分离的通量、灵 敏度和检测方面的问题。 第二章工作探讨了各种因素对CIEF分离结果的影响。主要研究了毛细管内 壁涂层、盐浓度、两性电解质浓度、电极液浓度和聚焦时问等实验条件对CIEF 分离结果的影响，并对CIEF的内在分离机理进行了初步探索，希望通过实验， 能对这种高分辨的分离技术有更深入的了解，以充分发挥其分离效率。为后续工 作打基础。 第三章首次建立了RPLC／CIEF／i。IF二维系统。RPLC是生物分析中常用的高 效的分离模式，对蛋白或肽等又很好的分离能力。CIEF与RPLC分离机理正交， 它不仅具有传统等电聚焦的高分辨率，又具有快速和易于自动化的优点。而且样 品容量大，与cRPLC的流量相匹配，且聚焦的过程中蛋白样品能富集几个数量级， 特别适合于第二维分离，能弥补第一维分离时造成的样品稀释，提高分析的灵敏 度。 用此二维系统对BSA酶解肽段和酵母蛋白进行了有效的分离，峰容量达NT i0000左右。并考察了荧光衍生对CIEF的影响，选择了巯基衍生染料而不是常 用的氨基衍生染料，结果证明巯基衍生对CIEF来说是一种适宜的方式，彳；会引 起pI的明显漂移，聚焦效果也不会受到影响，而且还不会损失某些蛋白组分尤 其是酸性蛋白。 第四章首创了用于ClEF阵列的全柱成像激光诱导荧光检测(WCID—LIF)，发 展了RPLC／CIEF阵列／二维系统，对高转移潜能肝癌组织蛋白组进行了高效的分 离检测，并对整个二维分离系统和检测系统申请了专利。 第二维采用CIEF阵列，使得分析通量得到很大的提高，弥补了ClEF相对于 凝胶IEF在通量上的不足。而且RPLC／CIEF阵列二维系统对第二维的分析速度 就没有苛刻的要求，因为第一维的馏分在第二维同时分离，可以充分优化ClEF 的分离条件，而不必受到速度的限制。这样，两个高分辨的分离模式组合起来， 不损失任何一维的柱效。整个系统就能具有很高的峰容量。 全柱检测对CIEF来说是一种更为高效的检测方式，能避免移动检测过程带来 的重现性问题。本论文首创性地发展了用于较高毛细管阵列数的全柱成像检测，