结肠癌脂肪酸代谢特点的DNA甲基化关系及研究.pdf

结肠癌脂肪酸代谢特点及DNA甲基化关系的研究 中文摘要 【目的】 建立气相色谱质谱法和液相色谱串联质谱分析组织脂肪酸和DNA甲基化方 法，比较结肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织脂肪酸的相对含量变化以及DNA甲基 化水平的改变，寻找脂肪酸代谢和DNA甲基化在肿瘤组织中的特点，探讨脂肪 酸代谢以及DNA甲基化与肿瘤发生发展之间的联系，为研究脂类与肿瘤的发生 发展关系和肿瘤诊断标志物提供科学依据。 【方法】 (1)组织脂肪酸提取以及分析：采用脂肪酸提取衍生一步法，在组织中加入正己 烷和14％三氟化硼／甲醇，充氮气后密封，100℃水浴加热1小时后加入三重蒸 馏水，然后吸取上清，用氮气吹干后，再用正己烷150“L定容，最后用气相色 谱质谱仪分析组织脂肪酸含量。 (2)组织DNA提取：在组织中加入蛋白酶K进行消化，然后加入苯酚．氯仿进行 除蛋白，最后加入乙醇把DNA沉淀下来，用紫外分光光度计进行DNA浓度以 及纯度的检测。 (3)组织DNA裂解：DNA样品加入88％甲酸在140C反应90min进行裂解。 (4)气相色谱质谱分析DNA甲基化：裂解后的DNA氮气吹干后，加入 BSTFA(I％TMCS)，乙腈和吡啶进行衍生，然后离心，取上清，然后用气相色谱 质谱仪进行分析。 (5)液相色谱串联质谱分析组织DNA甲基化：裂解后的DNA氮气吹干后，用甲 醇溶解后离心，取上清，然后用液相色谱串联质谱仪进行分析。 【结果】 (1)通过分析35例结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织的脂肪酸，比较肿瘤组织和 癌旁组织之间脂肪酸的差异， SFA、18：0／18：1、20：2和n．6／n．3在肿瘤组织中的 含量比癌旁组织的高且具有显著性差异， 18：l、20：5、20：5／20：4、22：6／22：4在肿 瘤组织中的含量比癌旁组织低也具有显著性差异。 (2)通过比较不同肿瘤分期的结直肠癌患者中脂肪酸含量，比较不同肿瘤分期的脂 肪酸之间的差异，发现C期结肠癌患者肿瘤组织中18：2和n-6脂肪酸的含量比B 期高具有显著性差异。 (3)在建立气相色谱质谱检测组织DNA甲基化方法时，通过正交实验优化胞嘧啶 和5．甲基胞嘧啶的衍生条件，得到其最佳衍生条件为100(2下加入 胞嘧啶衍生物在气相色谱质谱分析方法中容易分离，且最低检测限为0．05ng，日 分别为88．52％和92．35％。 (4)在建立液相色谱质谱检测组织DNA甲基化方法时，通过乙腈和甲酸铵在亲水 lpg，日内相对标准偏差分别为1．94％2．83％，日间相对标准偏差为2．17‰ 4．44％，胞嘧啶和5．甲基胞嘧啶的加样回收率为86．52％～105．14％。 (5)通过液相色谱串联质谱分析结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织中DNA程度， 发现肿瘤组织中的DNA甲基化水平比癌旁组织的DNA甲基化低(PO．05)，表示 低甲基化有利于肿瘤的发生。另外比较不同肿瘤分期结肠癌患者组织DNA甲基 化的差异，发现处于C期的结直肠癌患者中的DNA甲基化水平比处于B期的低 (尸如．05)。 (6)通过分析组织中脂肪酸含量以及DNA甲基化程度，发现组织脂肪酸与DNA 在组织中含量或比值增加，其相对应的DNA甲基化水平则降低(尸≮O．05)。 【结论】 本文建立了气相色谱质谱和液相色谱串联质谱分析组织脂肪酸和DNA甲基 化的方法，运用该方法分析了结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织中脂肪酸以及 2 DNA甲基化的程度。结果显示：与癌旁组织相比，肿瘤组织中18：1降低、n．6 脂肪酸升高，n-6脂肪酸随着肿瘤分期的递增而增加；肿瘤组织中DNA甲基化 水平显著降低；16：0、n-6系列脂肪酸在组织中含量的增加伴随着DNA甲基化水 平的下降。这些结果表明某些脂肪酸和DNA甲基化的变化与肿瘤的发生发展密 切相关，脂肪酸的代谢异常可能引起DNA甲基化的改变并导致肿瘤的产生。该 结果为深入研究肿瘤诊断及治疗标志物提供了科学依据。 【关键词】 结肠癌，脂肪酸，DNA甲基化，气相色谱，质谱，超高压液相色谱 The of acid andDNA in characteristicmetabolism fatty methylation thetissueofcolore