《NogoB—shRNA表达质粒的构建及其在大鼠原代肝星状细胞收缩中的作用.》.pdf

医 ) 2Ol4 四 川 大 学 学 报 ( 学 版 ；45(3)：362-366 JSichuanUniv (MeddSSceiEEddii) 。 NogoB—shRNA表达质粒的构建及其在大鼠原代 肝星状细胞收缩中的作用* 文茂瑶 ，门若庭 ，但雪莲 ，吴文超 ，杨 丽△ 1．四川大学华西医院 消化 内科 (成都 610041)；2．1~)ll大学华西医院 再生医学研究 中心 心血管疾病研究室 (成都 610041) 【摘要】 目的 构建针对大鼠NogoB基 因的 shRNA表达质粒 ，并初步探究其在大 鼠肝星状细胞 (HSCs)收 缩功能中的作用。方法 设计并合成针对大 鼠NogoB基 因 3个不 同位点的 shRNA，通过 DNA重组技术 ，将 shRNA插入 pSuper质粒 中，构建 NogoB-shRNA重组质粒 ，转染至大 鼠原代肝星状细胞(HSCs)中，并通过 Real— timePCR技术检测基因的相对表达量，筛选出能沉默大 鼠NogoB基因的重组质粒，再通过 Westernblot加 以验 证，同时观察NogoB基因被抑制后，HSCs中内皮素 1(Endothelin-1，ET一1)受体A、受体B(ETA、ETB)表达水平的 变化 。结果 构建的3对重组质粒 中，Nogot~shRNA2对 NogoB的基 因的表达具有 明显的抑制作用 。NogoB基 因被抑制后，大鼠HSCs中ETA的表达无明显变化，ETB的表达升高，ETA／ETB的水平降低。结论 成功构建 了有效、特异的抑制大 鼠NogoB基因表达的shRNA表达质粒，并初步观察到NogoB在肝星状细胞的收缩 中可能 有一定作用 。 【关键词】 短发夹 RNA NogoB 肝星状细胞 Construction ofshRNA Expressing Plasmid TargetedRatNogoB and Observation of theEffection aboutNogoB on HepaticStellateCells WEN Mao—yao ，M EN Ruo—ting ，DAN Xue-lian ，WU W en—chao。，YANG Li ． 1． Departmentof Gastroenterology，WestChina Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2． LaboratoryofCardiovascularDiseases，RegenerativeMedicineResearchCenter，WestChinaHospital，Sichuan University，Chengdu610041，China △ Correspondingauthor，E-mail：yangli—hx@SCU．edu．ca [Abstract] Objective ToconstructshRNA expressingplasmidinhibitingratNogoB andtOobserveits possibleeffectonratprimaryhepaticstellatecells(HSCs)contraction．Methods ThreepairsofshRNAstargeting differentsequence of ratNogoB were designed and constructed into pSuper plasmid by DNA recombination technique．Culture-activated HSCsweretransfected with NogoB-shRNA plasmids tO scan theeffective plasmid whichcouldinhibitNogoBgeneexpressionbyReal—timePCR．Andthisdepressanteffectwasalsoconfirmedwith W esternblot．AfterNogoB wasknocked—down effectively，ETA