大鼠精子ZP3结合蛋白sp56缺失肽的原核表达、纯化与抗体的制备.pdfVIP

大鼠精子ZP3结合蛋白sp56缺失肽的原核表达，纯化及其抗体的制各 摘要 哺乳动物卵透明带糖蛋白ZP3(zona3)是介导精卵初级结合，诱发精子 pellucida 发生顶体反应的关键分子。目前己在精子中发现多种ZP3结合蛋白，其中小鼠精子蛋 白sp56被认为是小鼠ZP3的受体候选者之一。至今，小鼠sp56的同源物只有从豚鼠睾 丸中克隆到的AM67。根据本实验室已有的研究基础，在大鼠精子中有两个转录本—— 结构域，而sp56s编码的蛋白前体则完全缺失了第三个Shshi结构域。 本研究根据sp561上第三个Shshi结构域设计两条引物，以本实验室已构建的大鼠 原核表达，筛选后，用谷胱甘肽一琼脂糖树脂亲和纯化，得不到可溶目的蛋白。 为了能在变性条件下亲和纯化出目的蛋白，换用PET-32a载体，同样用IPTG诱导 原核表达，筛选后用Ni—NTAHis—Bind树脂在变性条件下亲和纯化出了目的蛋白。 变形条件下亲和纯化所得的目的蛋白进行SDS．PAGE电泳后，切下目的蛋白条带， 剪碎后冻干，磨成粉末和完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混合后免疫兔子四次，免疫三 次后从兔耳缘静脉取血做EL