FANCD2 shRNA干扰对头颈鳞癌颈淋巴结转移细胞化疗敏感性的影响和机制的研究.pdf

shRNA干扰后HSC-4细胞的生长增殖情况，流式细胞术（Annexin V/PI染色 法 ）测定其凋亡和细胞周期改变； CCK-8 法检测顺铂 （Cis-diamminedichloroplatinum，CDDP ）在不同时间点及不同浓度作用于 HSC-4细胞的抑制率，并计算IC50值，流式细胞术测定CDDP作用后其凋亡 和细胞周期改变以研究FANCD2 shRNA干扰对HSC-4细胞化疗敏感性的影 响。通过Western Blot检测FANCD2 shRNA干扰后Bax 、ERK1/2 、P-ERK1/2 和integrin β1蛋白表达变化来探讨FANCD2与上述蛋白的功能关系；检测三 组细胞DNA交联剂作用后上述通路蛋白表达的变化，研究FNACD2 shRNA 沉默影响化疗敏感性的可能机制。结果：（1）Western Blot证实HNSCC颈淋 巴结转移HSC-4细胞存在FANCD2蛋白的表达；前期实验设计的干扰序列 使FANCD2沉默效应稳定，与对照组比较差异有统计学意义(F=514.179, P0.05) ，沉默效率为86%；（2 ）CCK-8结果显示shRNA沉默FANCD2表达 能抑制HSC-4细胞增殖，且抑制效应具有时间依耐性。不同浓度CDDP作用 48小时，三组细胞抑制率均随浓度增加而增高，各浓度组间 （F=1247.992, P0.05 ）和各细胞组间（F=118.724, P0.05 ）差异均有统计学意义，且实 验组抑制率增加较对照组明显；16μg/mlCDDP作用24 、48 、72小时，三组 细胞抑制率均随时间延长而增高，各时间组间 （F=575.013, P0.05 ）和各 细胞组间 （F=37.709, P0.05 ）差异均有统计学意义，且实验组抑制率增加 较对照组明显；实验组细胞CDDP 的IC50值（16.633±1.137）μg/ml 比空白对 照组（34.567±1.193 ）μg/ml和阴性对照组（30.400±0.089 ）μg/ml 明显降低 （F=229.887, P0.05 ）；（3 ）流式细胞术检测发现三组细胞培养72小时后， 实验组HSC-4细胞凋亡率（13.33 ％）较空白对照组（1.69％）和阴性对照 2 组（5.05 ％）明显增高 （F=403.277, P0.05 ）；FANCD2 shRNA干扰后细 胞周期变化为G0/G1期比例增加，进入S期细胞减少 （F=307.896, P0.0 1）。 0、2 、5μg/ml CDDP作用48小时，实验组细胞凋亡率较空白对照组和阴性 对照组增高 （F0μg/ml = 137.335, P0.05 ；F2μg/ml =581.633, P0.05 ；F5μg/ml =289.719, P0.05 ），且凋亡率随药物浓度的增加而增高；细胞周期G0/G1 期比例随CDDP浓度增加而增高，且实验组G0/G1期细胞比例与空白对照组 和阴性对照组相比差异有统计学意义 （F0μg/ml =4178.897, P0.05 ；F2μg/ml =33.864, P0.05 ；F5μg/ml =27.243, P0.05 ）；（4 ）Western Blot结果显示shRNA 沉默FANCD2表达，实验组Bax （F= 15.168, P0.05 ）和ERK1/2 （F= 14.888, P0.05 ）蛋白表达较对照组增强，P-ERK1/2 （F=35.288, P0.05 ）和integrin β1 （F=2.583, P0.05 ）蛋白表达降低；2μg/ml CDDP作用48小时后，实验 组Bax （F=25.218, P0.05 ）和ERK1/2 （F=30.345, P0.05 ）蛋白表达较对照 组增强，P-ERK1/2 （F=50.201, P0.05 ）和integrin β1 （F=22.227, P0.05 ） 蛋白与对照组相比表达降低。结论：（1）HNSCC颈淋巴结转移HSC-4细胞 系中存在FANCD2基因表达，且FANCD2基因shRNA沉默效应在HSC-4细胞 中稳定存在；（2 ）shRNA干扰沉默FANCD2表达能够抑制HSC-4细胞增殖， 促进其凋亡并导致细胞周期阻滞，提示FACND2可能与HNSCC 的生长活性 有关，这为下一步研究FANCD2基因功能及相关机制奠定了实验