LSECtinCRD在大肠杆菌中载体构建及其重组蛋白的表达.pdfVIP

目 录 LSECtin-CRD 在大肠杆菌中载体构建及重组蛋白的表达 1 1.1 中文摘要……………………………………………………………1 1.2 英文摘要……………………………………………………………3 1.3 前言…………………………………………………………………6 1.4 材料与方法…………………………………………………………9 1.5 结果…………………………………………………………………22 1.6 讨论…………………………………………………………………31 1.7 结论…………………………………………………………………35 1.8 参考文献……………………………………………………………37 2 英汉缩略词对照表…………………………………………………39 1[1 3 抗肝癌血管生成的分子靶向药物研究进展 （综述） ………………………………………………………………………40 4 致谢…………………………………………………………………41 附1 论文独创性及授权书………………………………………………51 LSECtin-CRD 在大肠杆菌中载体构建及重组蛋白的表达 摘 要 目的：为了获得足量可溶的重组蛋白C 型凝集素（liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin, LSECtin) 糖基识别结构域 （carbohydrate-recognition domains,CRDs ），便于进一步用位置定向自旋标 记- 电子顺磁共振方法 （SDSL-EPR ）研究生理状态下蛋白行使功能时构象 及运动性改变的动态结构信息，进行了一系列的原核重组蛋白表达实验的 研究。方法：（1 ）重组表达质粒的构建：拟构建三个不同载体， [PET-22b(+)-LSECtin-CRD、PGEX-6p-LSECtin-CRD 和PGEX-6p-LSECtin] 。 按实验目的对外源DNA 片段（LSECtin 和LSECtin-CRD ）进行引物的设计 与合成，PCR 扩增，琼脂糖鉴定PCR 扩增产物,鉴定正确后胶回收，双酶切 鉴定正确的PCR 片段，再次胶回收，获得纯化的外源DNA 小片段；提取 质粒[PET-22b(+)和PGEX-6p-1]，对质粒载体按实验要求双酶切后，胶回收， 获得纯化的质粒DNA 大片段。对质粒DNA[PET-22b(+)和PGEX-6p-1]以及 外源DNA （LSECtin 和LSECtin-CRD ）进行浓度测定。连接外源DNA 小 片段和质粒载体 DNA 大片段。将成功连接的三个不同表达载体 [PET-22b(+)-LSECtin-CRD、PGEX-6p-LSECtin-CRD 和 PGEX-6p-LSECtin] 转化DH-5α 感受态细胞，扩大培养后提取质粒，酶切鉴定正确后挑克隆摇 菌送invitrogen 公司测序。（2 ）重组蛋白诱导表达:将成功构建好的三个不同 的表达载体 [PET-22b(+)-LSECtin-CRD 、 PGEX-6p-LSECtin-CRD 和 PGEX-6p-LSECtin]转化至两个不同的宿主菌[BL21(DE3)和Origami(DE3)]， 挑单克隆，扩大培养，酶切鉴定正确，挑克隆进行重组蛋白诱导表达并进 行SDS检测蛋白表达情况，以及进一步用Western blot 鉴定重组蛋白 的表达。（3 ）重组蛋白的纯化复性:经优化比较，挑取表达良好的融合蛋白 [Origami(DE3)-PGEX-6p-1-LSECtin-CRD]进行蛋白诱导表达，收集菌体，纯 化复性，SDS检测蛋白的纯度，保存蛋白。结果:成功构建三种不同 的表达载体[PET-22b(+)-LSECtin-CRD, PGEX-6p-LSECtin-CRD，PGEX-6p- LSECtin]，在两种不同的宿主菌[BL21(DE3)和Origami(DE3)] 中均成功表达 大量重组蛋白，均以包涵体的形式存在。选取表达良好的融合蛋白[Origami （DE3 ）PGEX-6p-LSECtin-CRD]进行