Tat蛋白上肝素新结合位点的确定及功能的研究.pdf

Tat蛋白上肝索新结合位点的确定及其功能研究 Tat蛋白上肝素新结合位点的确定及其功能研究 摘 要 艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的人体免疫系统衰退性恶性传染病， 其流行形势仍然十分严峻。研究表明，Tat蛋白在艾滋病发生发展过程中具有重要 作用。作为HIV的最主要的调节蛋白，Tat不但通过反式激活效应参与病毒基因的 复制和表达，还可以分泌到胞外，抑制免疫细胞的分化和增殖，诱导其凋亡，激 活静止的CD4+T细胞，利于HIV的感染和体内传播，同时还能使正常或变形的血 管内皮细胞延伸、诱导血管生成或炎症发生，促进卡波氏肉瘤肿瘤细胞的发生、 生长，直接或间接作用于皮质层和皮质下层区引起神经系统的损害，导致艾滋病 痴呆，诱发肿瘤等。 肝素／硫酸乙酰肝素(heparin／HS)一直以来被认为是Tat蛋白发挥功能的分子 伴侣。广泛存在各细胞膜表面的HSPG是Tat蛋白的受体，对Tat在细胞表面的富 集、内化及随后HIV．LTR转录激活是必须的；反之，游离的heparin／HS可以竞争 性结合胞外的Tat抑制其与细胞膜表面HSPG的结合。细胞外基质中的heparin／HS 可以促进Tat蛋白在基质中积聚，增强内皮细胞的活化、生长、黏附和血管生成。 长期以来Tat上的碱性氨基酸区被认为是唯一的肝素结合位点，但近期研究发现对 碱性氨基酸富含区进行缺失或替换突变虽然影响结合但不足以阻断二者的相互作 用，提示，除碱性氨基酸富含区外，Tat蛋白上还存在其它肝素结合位点。进一步 确定Tat蛋白上其它Heparin结合位点，并探讨其在Tat功能中的作用，对阐明 Tat．heparin相互作用的本质以及针对于Tat靶点的抗艾滋病药物的研制都具有重要 意义。 Tat蛋白上肝索新结合位点的确定及其功能研究 本论文以计算机分子模拟为指引，借助分子生物学和生物芯片技术，首次发 素结合位点(KKR区)，这是继Tat蛋白己知肝素结合位点(碱性氨基酸区)之后 发现的另一全新位点。KKR区在序列上远离、但空间却毗邻相连。深入的生物学 功能研究表明，KKR位点不影响Tat的内化过程，但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝 素结合，利于Tat介导的整合素活化，促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力。 1、Tat蛋白上Heparin新结合位点的发现及确证 位点 在Tat蛋白NMR溶液构象基础上，我们建立了Tat蛋白同源模型作为分子模 拟中的目标蛋白，以肝素2、4、6、8寡糖片段为探针进行了对接。结果发现，Tat 蛋白上除了已知的肝素结合位点一序列线性相连的碱性氨基酸区外，还首次揭示 远离、但空间却毗邻相连。 (2)Tat及其系列突变体蛋白的制备 在计算机模拟的指导下，设计了新位点的单点、双点、三点突变以及碱性氨 基酸区与KKR区的共突变体，随后利用分子生物学技术，构建并表达纯化了相关 蛋白，并采用质谱技术对主要蛋白进行了鉴定，证明各突变体蛋白突变成功，为 Tat蛋白上肝素新结合位点的揭示奠定了物质基础。 (3)SPR技术确证了KKR区是Tat上Heparin的新结合位点 况，对新位点进行了确证，并对其特性进行了考察。结果发现，GST-Tat蛋白与 Tat蛋白上肝素新结合位点的确定及其功能研究 合能力完全消除，表明Tat蛋白上确实存在除碱性氨基酸区之外的另～个Heparin 用亲和力比较的策略，评价了KKR区中每个氨基酸残基在与Heparin相互作用中 的贡献。研究发现，KKR区进行单点突变时，蛋白质与Heparin结合的亲和力均 有部分降低；双点突变时，蛋白质与Heparin结合的亲和力呈明显降低；当Lysl2， Lys41，Ar978三个氨基酸全部突变后，二者的亲和力则显著降低。上述研究表明 的作用。 (4)KKR区为Heparin高亲和力特异性结合位点 亲和力的大小是结合模式中一个重要的评价指标，所以我们观察了新发现的 KKR区与Heparin结合的亲和力，即单纯突变碱性氨基酸区后计算二者的亲和力， 和力之间的悬殊差异使Heparin与Tat蛋白结合时优先占据碱性氨基酸区。竞争性 抑制实验是研究分子间相互作用的经典实验，其结果显示Heparin对GST-Tat、 较为明显，也从另一个方面表明KKR区是Tat蛋白与Heparin的更高的亲和力位 点。在计算机对接试验中也清晰的表明了这点，当探针为2糖片段时，其特异性 识别KKR区，随着糖链的增长，它在占据K