TMV侵染对烟草放氧复合体亚基表达的影响及其转psbO烟草的培育.pdfVIP

摘 要 放氧复合体(Oxygen-evolvingcomplex；OEC)是叶绿体光系统II的一个复合体，位于类囊 体膜的腔内侧，是叶绿体光反应过程中氧化水分子释放出氧气所不可缺少的。OEC是由三个已确 kDa、23 定的表观分子量为33 kDa和16 及～些还未确定的分子量更小的多肽组成。植物病毒学的新近研究结果表明OEC的多肽与病毒 侵染后的症状表达有密切关系。本实验以本生烟(Nicotiana 方法，克隆了编码OEC的三个主要多肽的eDNA核苷酸序列。其中，33kDa蛋白的cDNA序列 为98．76％，推导的氨基酸序列的同源性为99．10％；23 kDa蛋白)的同源性最高，为92．9I％，cDNA的 号为墨5墅丝(编码普通烟Ⅳtabacum的OEC23 编码序列同源’}生为97．07％，非同源的核苷酸主要位于3’端非翻译区，推导的氢基酸序列的同源 kDa蛋白 最高，为89．7％，推导的氨基酸序列同源性为88 6％。从普通烟与本生烟叶片中测得的核苷酸序 列与编码的氨基酸序列之间的同源性分别为98．6％和996％(见图2．10及2．11)。这是最先测得 16 的烟草OEC kDa，23kDa和16 分别为△兰!§垫!§，△￥2墼2Z§，△兰§§Z§堑(本生烟中33 kDa的eDNA序列) 和△望塑Z5丑(普通烟中16kDa的cDNA序90)。 将克隆到的OEC三种蛋自亚基的成熟肽的eDNA编码区进行亚克隆，与原核表达载体 和Westem blot分析表明，三种蛋白分别在大肠杆菌中得到了高效表达。采用金属Ni”螯合层析 方法及切胶回收的方法将融合蛋白纯化后免疫兔子，获得了特异性较高的抗血清。ACP．ELlSA 方法测定效价分别为i／2”，1／2”和1／2“。 利用己制各的抗血清，测定了烟草花叶病毒侵染本生烟(Ⅳbenthamiana)和普通烟(Ⅳ tabaeum)后上述三种蛋白的表达变化。烟草花叶病毒侵染本生烟表现症状为系统性叶片变小、 向下卷曲，植株矮化，逐渐死亡；侵染普通烟(．Ⅳ：tabacum)表现出典型的系统性花叶症状。Western kDa blot分析结果表明，TMV侵染酱通烟后，与对照相比，33kDa蛋白水平没有显著的变化，23 和16kDa蛋白水平显著降低。TMV侵染本生烟后，与对照相比，三种蛋白的表达量均没有显著的 变化。以上OEC蛋白亚基表达差异可能与不同症状表现有关。 将33 化普通烟(Ⅳ．tabacum)，获得33kDa蛋白的过量表达及抑制表达的转基因植株。并将OEC三种 蛋白亚基部分eDNA序列与双生病毒载体连接，构建了引起基因沉默的重组病毒载体，为后续基 因沉默的研究奠定了基础。 Abstract OECisoneofthethree ofthePSIIof membraneswhich sub-complexes chloroplastthylakoid waterto issituatedonthelumenalsideofthe membraneandis oxidize oxygen．It thylakoid composed ofthreewellcharacterized and16kDa a of33，23 proteins numberoflesswellcharacterizedsmaller studiesin showedOEC