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免疫学检验 标 记 免 疫 技 术 广东药学院公共卫生学院 赵晓蓉 基本概念 一、免疫标记与标记免疫的概念 免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术 标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术 酶标仪 荧光显微镜 β液闪仪γ计数器 标记免疫技术的分类 一、按指示标记物质划分的类型 二、按测定方式划分的类型 三、按测定用途划分的类型 第八章 酶免疫技术 本章要求 熟悉酶免疫技术的分类及原理； 掌握ELISA的方法类型及各方法的原理；测定方法的标准化； 熟悉酶免疫组织化学技术的原理；了解各类酶免疫组织化学技术； 熟悉免疫印迹法的原理。 （二）双位点一步法 属于双抗体夹心法测定抗原； 应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体； 标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。 简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。但要注意防止钩状效应。 （三） 双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。 形成“抗原-抗体-酶标记抗原”复合物 固相酶免疫测定的技术要点 ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液 试剂的准备 固相载体：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白质的能力较强，抗体或蛋白质抗原吸附其上并保留原来的免疫活性。载体的性状主要有三种：小试管、小珠和微量ELISA板。 抗原和抗体：所用抗原要求纯度高，抗体效价高，结合力强。 酶和底物： ELISA中最常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶 测定方法的标准化 包被+封闭 加样 洗涤 孵育 终止反应 结果的判定 包被 将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。 这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 包被用抗体 IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。 （二）加样 定量测定加样量应力求准确，加样时应将液体加在孔底，力求不产生气泡。样本和结合物的稀释应按规定配制。 一般100μl/孔 （三）洗涤 洗涤是决定实验成败的关键。其目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 Tween 20在ELISA中最为常用，洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。常用PBS- Tween 20。 洗涤步骤 孵育 (incubation) 抗原抗体完成反应的保温过程称为孵育 加样品后、加结合物后都要孵育 孵育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。 一般孵育30-60min，温度低，时间可延长。 （五）结果的判定 分光光度计检测结果可简单地用吸光度值（A）表示，并且根据每次试验所用的阴性和阳性样本确定标准。 一般以A/A0≥2.1（A：样本吸光度值，A0：阴性对照吸光度值）表示，但阴性对照吸光度值必须大于0.05（最理想的是0.1），若低于0.05，则以阴性对照吸光度值加0.05为阳性判断标准，这种结果判定方式目前最常用。 用标准抗原或抗体做一系列稀释度检测，将测定的A值绘成标准曲线，可对样品中抗原或抗体定量。 用肉眼判断结果时，所用的底物必须显示较深的颜色。肉眼观察只能判断阳性和阴性（如+++、++、+、+/－、－）。 酶免疫组织化学技术（EIHCT ） 是在一定条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应。如组织或