U87EGFRvⅢ细胞适配子的筛选及介导siRNA转运的初步应用.pdf

siRNA转运的初步应用 硕士研究生：谭燕 指导教师：张兴梅副教授 摘 要 恶性多形性胶质瘤(glioblastoma 瘤，预后非常差：成年病人1、3或者5年的生存期的概率大约分别为30％、5％、 3％。在20％～30％的GBM病人中存在人表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor 研究证明其表达变化与GBM的恶化及放、化疗抗性有密切关系；在其它恶性肿 瘤如非小细胞肺癌、大肠癌、结肠癌等中均存在不同程度的EGFR及EGFRvIII 的高表达。因此EGFR及其突变体可以作为肿瘤治疗的主要靶标。目前，EGFR 单克隆抗体已经应用于临床治疗，这种抑制剂阻断EGFR受体，使得EGFR的 酪氨酸激酶信号通路失活，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。由于抗体药物本 身的免疫原性，且EGFR在正常组织中也表达，EGFR单克隆抗体的应用出现 了许多不良反应、长期使用易出现耐药性，因此开发靶向性强、免疫原性小、 分子量小、毒性小、稳定好的制剂更为重要。另有研究表明EGFRvlII仅在肿瘤 组织中表达，可作为高特异性的治疗靶标；而核酸适配子技术的发展为新的抗 肿瘤药物的研发提供了可能。 适配子(aptamer)是能形成特定的三维空间结构的寡核苷酸，以高亲和力 和高特异性与靶分子结合。与传统的抗体相比，适配子有如下特征：分子量小， 可在体外快速合成，易于化学修饰；稳定性好便于长期储存；毒性低，免疫原 性小；有较快较好的组织渗透性。这些优点使得适配子可用于疾病的诊断和治 摘要 evolutionof 疗。适配子可通过指数富集配基的系统进化技术(systematicligands byexponential 选得到。 近几年有研究报道筛选出更复杂靶分子的适配子，如细胞膜蛋白、全细胞 定靶分子蛋白，且靶分子或者靶蛋白能在活性状态下维持细胞表面正常的空间 结构和糖基化位点，这样易于筛选出肿瘤细胞表面的新的靶分子或靶蛋白，对 肿瘤标记物的发现有重要意义。 文库中筛选出与U87．EGFRvlII细胞高亲和力、高特异性结合的适配子。利用经 典ELISA的方法和生物素．链亲和素系统，建立并进行细胞酶联反应(cell enzyme．1inked 力；利用共聚焦显微镜检测技术寻找能被U87．EGFRvIII细胞表面受体介导内吞 的适配子，并用此适配子作为一种传递c．MetsiRNA进入细胞介导基因沉默的工 具。 成两端为固定序列、中间为30个nt的随机序列、全长为76个nt的ssDNA文 库。以贴壁培养过夜的U87．EGFRvlII细胞为靶标，经过孵育、洗涤、分离后， 通过不对称PCR法分离单链ssDNA，大量扩增得到下轮筛选的亚库。筛选过程 中不断增加筛选的强度(如增加鲑精DNA量、缩短孵育时间、增加洗涤强度等)。 从第四轮筛选开始，每轮引入EGFRvlII蛋白表达阴性的U87细胞作为反筛细胞， 以去除细胞表面相同受体或者结构的干扰，经过14轮cell．SELEX筛选和鉴定， 得到与U87．EGFRvlII细胞高亲和力、高特异性结合的适配子。 用生物素标记的上游引物对所筛选的亚文库进行不对称PCR扩增，得到生 II 硕士学位论文 U87细胞的结合力，在细胞数目和投入的ssDNA的量相同的条件下测定吸收度， 从而判断出筛选过程中结合到U87．EGFRvlII细胞上的ssDNA的富集情况。 将第14轮的筛选产物进行扩增、纯化、T载体克隆、“蓝．白”斑筛选并测序， STRUCTURE 得到相应适配子的序列，并用RNA 5．2软件预测DNA的二级结构， 并将这些结构进行分类，根据序列的相似性挑选出进行后续功能研究的适配子。 为了鉴定适配子的特异性和亲和力，用FITC标记适配子，然后与 U87．EGFRvlII细胞孵育结合，于荧光显微镜下观察结合情况；用流式细胞技术 回归分析获得适配子的解离常数。 共聚焦显微镜定位观察适配子与U87．EGFRvlII细胞的结合位点，寻找能被