Smad1互作蛋白chmp1b的筛选及其初步鉴定分析.pdf

||IIII I III I T I I rUI llIIl ＼1892417 目 录 一、摘要 中文论著摘要……………………………………………………………………．．1 英文论著摘要……………………………………………………………………·．3 二、英文缩略语………………………………………………………………………．6 三、论文 ．’，．_一 刚吾…………………………………………………………………………………………………………·7 材料与方法………………………………………………………………………．8 实验结果…………………………………………………………………………18 讨论………………………………………………………………………………………………………．．24 结论………………………………………………………………………………………………………．．26 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………27 五、参考文献…………………………………………………………………………28 六、附录 综述………………………………………………………………………………………………………”3l 在学期间科研成绩………………………………………………………………41 致谢………………………………………………………………………………………………………．．42 个人简介…………………………………………………………………………43 ·中文论著摘要· b的筛选及初步鉴定分析 Smadl互作蛋白chmpl 刖舌 Tgf-6生长因子在肺发育过程中对胎儿及新，LJLB,IJ发育过程中肺上皮细胞 的生长、分化、免疫调节、细胞外基质的合成及肺组织损伤后的修复等过程都起 BMP信号转导途径中重要的细胞内信号分子，BMP的信号传导过程始于对跨 膜的BMP I型和II型受体的激活，激活的I型受体对下游负责胞内信号传导的 形式进入细胞核内与特异性转录因子一起调节相关基因的表达。而通过敲除小鼠 肺上皮细胞中的BMP基因抑制其表达会造成胎鼠产前肺发育畸形等致死性结 果。所以，针对这条重要的信号通路以及其中涉及的各种信号分子之间作用的探 索近年来成为了肺发育与疾病领域中研究的热点问题。 发育过程中，小鼠胚胎肺上皮细胞中敲除Smadl会导致其分化过程受到影 响，并会最终导致新生呼吸衰竭。而Smadl本身作为一种细胞内信号分子其作 用的发挥需要互作蛋白的协助。因此本实验通过酵母双杂交体系对E18．5天小鼠 胚胎肺文库中与Smadl可能存在相互作用的蛋白进行筛选，并用多种方式对前 期筛选出的chmplb是否与Smadl在体内及体外存在相互作用进行初步确认，同 时检查chmplb其在不同发育阶段肺内的表达水平，为研究TGF—B信号通路对 肺发育的影响探寻新的思路 方法 l、酵母双杂交文库的建立 2、Smadl诱饵载体的构建 3、Smadl酵母互作蛋白的筛选 4、chmplb与Smadl不同结构域的酵母体外小规模mating互作验证确认 5、pcmbl质粒的构建。 6、chmpl与Smadl的细胞内荧光共定位实验 pulldown验证cllIllplb与Smadl的互作 7、Halo—tag 8、用Realtime PCR检测不同发育阶段肺组坌)1,chmplb表达量水平 结果 l、小鼠E18．5酵母双杂交文库建立完成。 2、构建了Smadl诱饵载体并通过酵母互作蛋白筛选体系筛选出640个酵母克 隆菌株 4、pcmbl质粒的构建成功。 5、chrnplb与Smadl细胞内荧光共聚焦实验显示在胞核和胞浆中存在共定位