绵羊肺腺瘤病毒受体hyal-2的原核表达及多克隆抗体制备.pdfVIP

摘 要 目的：克隆绵羊肺腺瘤病毒受体h．rM-2基因全长，将其重组入原核表达载 体中，构建重组质粒，进而转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，进行诱导表达，利 用亲和层析的方法纯化出Hyal一2蛋白，制备hyM一2的多克隆抗体，为进一步 鉴定JSRV感染的组织细胞，探究JSRV的组织嗜性奠定基础。 方法：本研究根据已报道的hyal-2基因序列，经primer5．0软件设计一 对特异性的引物序列，利用PCR方法扩增hyaT-2基因序列，并将其重组入 及测序，鉴定重组质粒构建的正确性。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经 效地表达，本试验分别对重组菌表达GST—Hya]一2融合蛋白的IPTG诱导浓度、 诱导时间、温度进行了优化，摸索最佳的表达条件。进而利用谷胱甘肽亲和层 析的方法对目的蛋白进行亲和纯化，将纯化后的目的蛋白免疫家兔，制备 Hyal一2蛋白的多克隆抗体，经双向琼脂扩散实验测定多克隆抗体的效价，经 Western blotting检测多克隆抗体的特异性。 结果：利用PCR方法成功扩增出了囊阳』誓基因片段，大小为1431bp，测 序结果显示hyal-2基因正确的插入到表达载体中，成功构建了 ku，Western 融合蛋白，蛋白大小为80 blotting也进一步验证了融合蛋白的 表达。利用谷胱甘肽亲和层析的方法，纯化出了目的蛋白，利用Bradford法测 得蛋白浓度为636．1∥g／mL，与佐剂充分乳化后，免疫家兔，制各出了兔抗 Hyal一2蛋白的多克隆抗体。双向琼脂扩散实验结果显示，多克隆抗体的效价达 到了1：16，经Westernblotting分析表明制备的多克隆抗体能够识别Hyal一2 蛋白，且特异性较好。 达出了Hyai一2蛋白，免疫家兔制备出了绵羊肺腺瘤病毒受体hyal一2的多克隆 抗体。 关键词：绵羊肺腺瘤病毒：受体；透明质酸酶一2：原核表达；蛋白亲和纯化； 多克隆抗体制备 Retrovirus Prokaryotic JaagsiekteSheep Receptorhyal一2 and of PreparationPolyclonalAntibody Expression Abstract clone gene， 0bjective：ToJaagsiektesheepvirus(JSRV)receptorhya，．2 thentransformitintoBL2 prokaryoticexpressionvector,and 1(DE3)E．coli． prepare After and inducing Hyal-2proteinpreparapolyclonal expression，obtain，punfy of has academic for the antbodyHyal·2．Itveryimportant significanceidentifing of infectedcellsofJSRVandtofurtherthetissue JSRV． study tropism tothe of Methods：Accordingpublishedsheep