《分子生物学实验指导》.pdfVIP

分子生物学实验指导 主编:王海鸥 魏巍 宣劲松 钟广蓉 北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系 2007.6 前言 分子生物学实验课程是一门年轻的课程。20 世纪 90 年代初期，随着分 子生物学日新月异的发展，分子生物学实验技术已成为生命科学各学科重要 的研究工具。高等学校生命科学各专业的学生要适应时代的发展，除了需要 学习分子生物学理论和分子生物学技术的基本知识以外，还必须系统地培养 学生在分子生物学方面的技术素养与动手能力，于是我们在 2005 年正式将 分子生物学实验作为一门独立的课程，并作为生物技术专业学生的必修课。 单独开设分子生物学实验这门课后，在原有的基础上又增加了许多新的，分 子生物学技术和实验内容。而且对全部新增设内容都进行了充分的摸索和预 实验，直到每个实验课堂教学上可行。学生通过此课程既学到了适应时代前 沿的技术，又大大增加了他们的实践和动手能力。在此基础上我们编写了学 生用的《分子生物学实验指导》。 全书内容包括感受态细胞的制备和转化；质粒的提取和酶切；DNA 重 组；PCR 基因扩增；哺乳动物和植物基因组 DNA 的分离和提取；凝胶电泳 检测蛋白质和DNA ；Southern 杂交；蛋白质印迹和免疫检测；总RNA 和tRNA 的制备及分析；核酸序列测定；在原核细胞中表达真核基因；基因突变及检 测等。书后还摘编了许多对分于生物学实验有用的附录。为适合不同领域对 象的需要，对某些实验内容，安排有以动物为材料或以植物为材料的不同实 验。为适合不同水平的对象，除最基础的实验外，还编排了较高层次的实验。 实验一 质粒 DNA 的分离纯化 [实验目的] 通过质粒的一些特性对质粒 DNA 的提取、测定 学习用碱变性法提取质粒 DNA [实验原理] DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致 DNA 的变性，如加 热、极端 pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使 DNA 复性。 SDS 是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋 白质变性，所以 SDS 处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质 粒 DNA 以及基因组 DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的 DNA 遇到强碱性 （NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中 性，质粒 DNA 将迅速复性，而染色体 DNA，由于分子巨大，难以复性。离心 后，质粒 DNA将在上清中，而染色体 DNA 则与细胞碎片一起沉淀到离心管的 底部。通过这种方法即可将质粒 DNA 从细菌中提取出来。 [器材与试剂] l、实验仪器 1.5 mL 塑料离心管 10 个，0.5 mL 塑料离心管 7 个，塑料离心管架（30 孔）1 个，20 、200 、1000 µL 微量加样器各一支，常用玻璃仪器及滴管等， 台式高速离心机,恒温摇床,恒温培养箱,高压灭菌锅。 2 、实验材料 大肠杆菌 JM109 。 3、实验试剂 （1） pH 8.0 G. E. T 缓冲液（50 mmol ／L葡萄糖，10 mmol ／L EDTA-Na2 ，25mmo1 ／L Tris －HCI ）；用前加溶菌酶4mg ／mL 。 （2 ） 0.4 mol/L NaOH, 2% SDS, 用前等体积混合（现配）。 （3 ） pH 4.8 乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5 mL冰醋酸，28.5mL H2O ）：该溶液钾离子浓度为3mo1 ／L ，醋酸根离子浓度为 5mo1 ／L 。 （4 ） 酚／氯仿（1：1，V ／V ）：酚需在 160℃重蒸，加入抗氧化剂 8-羟基喹啉，使体积分数为 0.1 ％，并用Tris －HCI 缓冲液平衡两次。 （5 ） 70%乙醇。 （6 ） pH8.0 RTE 缓冲液： 10mmo1 ／L Tris-HCl ，1mmol/L EDTA， 其中含 RNA 酶（RNaseA ）20µg/mL 。 [实验步骤] 1、培养细菌:将