大黄欧文氏菌蔗糖异构酶基因克隆表达及其酶学特性研究.pdfVIP

第 4l卷 第 4期 工 业 微 生 物 VoI．4lNo．4 2011年 O8月 IndustrialMicrobiology Aug．2011 doi：10．3969／j．issn．1001—6678．2011．04．003 大黄欧文氏菌蔗糖异构酶基 因克隆 表达及其酶学特性研究 周 兴 ， 韦星明 ， 杨祥开 ， 郑元涛 ， 许黎明 ，黄 日波 ’。’ (1．广西大学生命科学与技术学院，南宁 530005；2．广西科学院生物研究所 ，南宁 530007； 3．生物质能源酶解技术国家重点实验室，广西科学院，南宁530007) 摘 要：通过PCR克隆得到了不包括信号肽序列的 109～1803bp大黄欧文氏茵蔗糖异构酶基因， 以pQE30为表达载体可以在大肠杆菌中高效表达SI基因，但容易形成包涵体。通过降低诱导剂 IPTG至 10gmol／L，28℃低温诱导表达可以改进表达产物的可溶性。重组SI的最适pH为6．0， 最适反应温度为 30℃。测定的Km 为46．8mmol／L，Vma,3c为 152．2u／mg。重组 SI对麦芽糖、 海藻糖、棉子糖、三氯蔗糖及 甲基葡萄糖苷等均不起作用，只利用蔗糖为底物转糖苷，也可以水解 对硝基苯酚a葡萄糖苷。同时发现重组sI具有转化异麦芽酮糖生成海藻酮糖的活性。 关键词：大黄欧文氏茵；蔗糖异构酶；酶学特性；异麦芽酮糖；海藻酮糖 异麦芽酮糖 (isornaltulose，6一O廿D-glucopyra— 糖转化率降低n 。克隆大黄欧文氏菌的蔗糖异构 nosyl-D—fructofuranase)通常称作帕拉金糖 (palati 酶基因，构建能够高效表达蔗糖异构酶基因的工程 noSe)，其甜度为蔗糖的42％1『-2]，甜味特征与蔗糖 菌，可为工业化生产异麦芽酮糖提供优质安全高效 极为相似，但 由于 口腔致蛀齿微生物不能利用，因 的酶源，并将为研究蔗糖异构酶的作用机理及其分 此而作为一种不致龋齿的蔗糖替代品应用于食品工 子改造奠定基础。 业 一引。 1 材料与方法 目前，工业上生产异麦芽酮糖均采用酶法转 化[9^1¨。蔗糖异构酶 (SI，sucroseisomerase，EC5． 1．1 菌株、质粒和培养条件 4．99．11)可以转化蔗糖形成蔗糖的同分异构体一异 表达载体pQE30购 自Qiagen公司，E．coli5a 麦芽酮糖和海藻酮糖(trehalulose，1一O心D-glucopyr 作为克隆宿主，E．coliM15为表达宿主。所有 E． anosyl—D-fructofuranase)，并伴随产生少量水解产物 coli菌株均用 Luria-Bertani(LB)培养基培养，并根 — 葡萄糖和果糖[1J 。大黄欧文 氏菌 (Erwinia 据实验需要加入所需浓度的抗生素。大黄欧文氏菌 rhapontici)曾应用于异麦芽酮糖的生产，但是 由于 Er~iniarhaponticiNCPPB1578的培养基及培养 大黄欧文氏菌本身是一种植物病原菌n ，使得它在 条件：蔗糖40 L，蛋 白胨 10g／L，牛肉膏4 L，调 工业化应用中受到限制。另外，近年随着其异麦芽 pH至 7．0。30℃振荡培养70h。 酮糖代谢基因簇的克隆和鉴定，已发现大黄欧文氏 1．2 基因克隆和表达质粒构建 菌还带有能够水解异麦芽酮糖的异麦芽酮糖水解酶 PCR扩增条件：94℃变性 30S，54℃复性 40S， 基因，该基因的转录受异麦芽酮糖诱导，因此在以野 72℃延伸 2rain，扩增 30个循环。PfuDNA聚合酶 生型的大黄欧文氏菌生产异麦芽酮糖将由于其所产 为上海生工产品。其余限制性内切酶切、连接等均 生的异麦芽酮